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凌科生物科技（上海）有限公司
上海浦东川沙路159弄88号1栋3楼
021-171173
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产品名称配方类型是否含上样染料目录号包装形式2X TaqMasterMix  高特异性版无染料型PM001-S1mlX5快速上样型PM001-SQ1mlX5产品描述：        2×Taq Master Mix是由Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2以及反应缓冲液按优化比例配制成的2×反应混合物。使用时，只需再加入模板和引物并稀释至1×浓度即可进行PCR反应，大大地简化了配置过程，减少了误操作率。        2×Taq Master Mix (高特异性版)专门为常规PCR鉴定及对特异性要求较高的PCR鉴定实验优化，并具有应用范围广、高效率、较高灵敏度、高稳定等特点。        2×Taq Master Mix提供无染料型/快速上样型（含蓝色染料）两种形式，快速上样型在PCR反应完成后无需混合Loading Buffer，可直接电泳，节省时间。经测试，高纯度染料的加入不影响PCR反应。   产品特点： 应用范围广：可直接用于菌落/菌液PCR鉴定、质粒、基因组DNA PCR扩增。较高灵敏度：可从0.1ng人基因组模板中扩增出特定片段。高效率：最长扩增8kb，对5kb以内片段扩增效率高。稳定：反复冻融50次，4℃放置30天，扩增性能不受影响。便捷：数分钟即可完成反应体系配制，20μl至50μl体系全部适用。PCR反应后可直接上样（快速上样型）。 产品用途：1）常规PCR鉴定及较短片段的PCR克隆；2）对特异性要求较高的PCR扩增及鉴定实验；3）平端PCR产物加A； 应用实例：实例一）  使用2×Taq Master Mix (高特异性版)分别对100ng～0.1ng小鼠基因组DNA模板进行扩增，可很好地扩增出1.1kb的 DN**段（IL-1b基因）。  模板量: 泳道M：DNA Ladder 2000 泳道1：100ng； 泳道2：10ng；泳道3：1ng； 泳道4：0.1ng；   使用建议： 菌落及菌液PCR鉴定：2×Taq Master Mix(高灵敏度版)可直接用于菌落或菌液PCR鉴定，使用菌落及菌液作为模板时，请注意勿加入过多的菌落或菌液，通常情况下，痕量的菌体、0.2μl甚至更少的菌液即可获得很好的PCR结果，模板过多会造成过多的非特异性扩增，甚至导致反应失败。反应配置：请在冰上配制PCR反应体系，然后直接置于PCR仪上进行PCR，此方法（冷启动）能有效减少非特异性扩增。PCR程序设置：本制品扩增灵敏度较高，推荐扩增循环数25至30个，过多的PCR循环，有可能导致高于目的条带位置出现"Smear现象"。增加扩增灵敏度：PCR扩增灵敏度和特异性是一个硬币的两面，获得PCR高特异性的同时，往往需要损失一些扩增灵敏度，如需增加扩增灵敏度，可尝试采用“Touch Down PCR”或适度降低退火温度、增加扩增循环数，或改用本产品的高灵敏度版。 PCR污染防治：如实验室长期需要对同一片段进行扩增，请尽量避免使用同一套移液器进行体系配置与PCR产物电泳上样工作，并建立良好的PCR实验分区操作规则。我们推荐采用防污染2× Taq Master Mix，从根本上解决PCR产物气溶胶及其他交叉污染途径造成的PCR污染。TA克隆：使用本制品扩增得到的PCR产物具有3端"A"突出，可直接克隆于T-Vector中。产品保存：本制品如需长期保存，请至于-20℃冰箱冻存，4度冰箱可短期存放。如为方便使用，需长期置于实验台上或4度冰箱，可选用 2×Master Mix室温稳定型。
ØBioLinker 2X Taq
MasterMix 系列产品选择指南
*以上每种产品均可选择：   高灵敏度版/高特异性版 ，快速上样型/无染料型
几种不同产品规格
2x Taq Master Mix 选购目录热卖目录号产品名称防污染室温稳定快速扩增高灵敏度快速上样（含染料）高特异性包装形式目录价格　PM111-HQ防污染 High-Speed 2X Taq√　√√√　1mlX5￥540 　PM111-H防污染 High-Speed 2X Taq√　√√　　1mlX5￥540 　PM111-SQ防污染 High-Speed 2X Taq√　√　√√1mlX5￥460 　PM111-S防污染 High-Speed 2X Taq√　√　　√1mlX5￥460 　防污染 2X Taq MasterMix  √　　√√　1mlX5￥460 　防污染 2X Taq MasterMix  √　　√　　1mlX5￥460 　防污染 2X Taq MasterMix  √　　　√√1mlX5￥360 　防污染 2X Taq MasterMix  √　　　　√1mlX5￥360 　High-Speed 2X Taq 室温稳定型 　√√√√　1mlX5￥540 　High-Speed 2X Taq 室温稳定型 　√√√　　1mlX5￥540 　High-Speed 2X Taq 室温稳定型 　√√　√√1mlX5￥460 　High-Speed 2X Taq 室温稳定型 　√√　　√1mlX5￥460 hot2X Taq MasterMix 室温稳定型　√　√√　1mlX5￥460 　2X Taq MasterMix 室温稳定型　√　√　　1mlX5￥460 　2X Taq MasterMix 室温稳定型　√　　√√1mlX5￥360 　2X Taq MasterMix 室温稳定型　√　　　√1mlX5￥360 　High-Speed 2X Taq 　　√√√　1mlX5￥460 　High-Speed 2X Taq 　　√√　　1mlX5￥460 　High-Speed 2X Taq 　　√　√√1mlX5￥360 　High-Speed 2X Taq 　　√　　√1mlX5￥360 hot2X Taq MasterMix　　　√√　1mlX5¥360 　2X Taq MasterMix  　　　√　　1mlX5¥360 　2X Taq MasterMix 　　　　√√1mlX5¥280 　2X Taq MasterMix 　　　　　√1mlX5¥280
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请教touch down
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这个帖子发布于13年零353天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请问大牛：比如我的程序是55度条带最好。那么：1。 我如何选择touch down 的范围2。
touch down 的原理是什么。为什么要用touch down呢。我感觉从原理上好像用处不大啊。谢谢
不知道邀请谁？试试他们
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简而言之，“touch down” PCR 是一种寻找最佳复性温度的方法。它是用“热循环PCR仪”在连续的循环中逐渐降低复性温度的方法来确定最适Ta，所以只用一次PCR就可以确定最适Ta值，避免了对每对引物进行最佳复性温度的优化与测定工作。也就是说，一次就可以搞定。
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但是我看很多关于DGGE的文献，并不单单是为了找到一个好的条件后就用这个条件来P,而是一直用touch down来扩增环境DNA.清继续指教。谢谢了。
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运用touch down PCR的主要目的是增强PCR扩增的特异性.我在实际应用中一般采取step down的程序.以55度为例,可从60度down到52度,每一cycle down 0.5度,然后,52度作20 cycle.
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如果你已经知道你的程序是55度条带最好，你就完全没有必要去考虑touch down 。touch down 的原理是通过一系列的递减退火温度(其中一定要包含你的最佳退火温度)来得到你一轮PCR扩增产物，然后再用一个低于你最佳退火温度的退火温度来做后续的扩增，从面得到你所需要的产物。这种PCR是在你知道你的PCR的退火温度的大概范围，又不想去仔细摸索最佳退火温度时用，通常情况下可以得到你所要的扩增产物。以上见解供参考。
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可是那为什么好多文献都是一直用touch down来扩增环境DNA. 好像他们的意思是为了得到更多类型的产物。比如说，环境样品中一共有10种dna,按照最佳的pcr应该可以扩增出来10种产物（虽然是同一个大小），但是大家都知道不可能，也许用普通的pcr 只能扩增5种产物，如果用touch down也许可以扩增出8条，就是说可以扩增出来的“种类”增加了。请问是不是呢。如果是，那原理是什么呢。谢谢。
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退火温度降低,引物和模板特异结合能力减弱,从而给其他模板提供了结合的机会
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好像也不是啊。touch down 的范围一般是在普通pcr退火温度的上面10度啊。好像目的是为了给退火温度高的模板机会一样。
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我的touch down 就是用来增加特异性，因为摸索最佳温度很麻烦。我较懒，所以一般都是touch down 进行pcr
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比如Tm62度，先65到50度做每两个循环降低一度的反应这就是30个循环，在50再做15个，45个循环。TD PCR要做那么多循环，如果用常规量的酶，引物等成分，会不会不够？需要加量吗？标准是什么？
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关于丁香园重叠PCR和Touchdown&PCR
最近要扩大片段了，先用高保真试试，不行就只好分段扩了。在网上搜到一些重叠PCR和Touchdown的经验，先贴上来。希望我那几个候选基因都能顺利扩出来~~
关于重叠PCR：
转载地址1：
重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5-
atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5-
atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为：
A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3
A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3
B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3
B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3
我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。我们来看重叠PCR的步骤：
（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因
（2）回收A，B基因
（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B.
第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及
TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦。
目前重叠PCR的应用十分广泛，比如说在基因的定点突变，虽然说现在有很多的突变试剂盒，应用起来也很简单，但那是需要银子的；人工合成基因，其实人工合成基因最基本的技术（目前应用最为广泛的）就是利用重叠PCR的方法；启动子与目的基因的串连；两个不同表达盒的连接，大家都知道我们在使用DNA调取或者说扩增基因的时候，往往需要将几个表达盒串连起来观察他们的表达效果，但由于绝大多数的DNA中都含有内含子，也就是说几个外显子并不是串连在一起的，而要想达到我们的目的，只要应用重叠PCR技术就可以轻松完成。
&&& overlap
能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。
&&&另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。
如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDown
PCR试试。TouchDown
PCR方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。Touch
Down PCR有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。
转载地址2：
最近由于实验需要，做了两组pcr，连接了一个启动子，一个调控子，还有一个抗性基因，三天就搞定。
三个pcr片段分别为131bp, 650bp., 927bp
如果你扩增的片段特异性好，用PCR回收试剂盒回收，方便快捷。
如果有杂带，只能切胶回收了。下面从pcr引物设计，重叠pcr两个方面说一下。
1.重叠pcr引物设计
很简单，就是和你平常的引物设计一样。两个基因的引物都设计好了后，如：
A基因：5‘TTAAGACCCACTTTCACATT3’&&&&&&&
5‘ TAGATTAGATAAAAGTAAAGTG3’ 下游序列
5‘ CATTAATTCCTAATTTTTGTTG3’ 上游序列
GATTTTTGTCGAACTATTC3’&&&&
把A基因的下游序列全加到B基因上游序列的5'端
把B基因的上游序列全加到A基因下游序列的5‘端
就万事OK了，别想着替你老板省钱，那是让你自己找罪受！
2、重叠pcr的做法
两个基因的pcr产物回收后
20ul体系，各取1ul,其它的如加酶等一切照常，但先不加两端引物。
72度1min&&&&
加两端引物：A基因的上游序列和B基因的下游序列
72度1min&&&&
延伸时间视你的基因长短来确定，一般普通taq酶1kb 1min, 高保真酶 1min ,800bp
over还有一个很重要的问题是，你们扩基因的时候要用高保真酶，用普通TAP酶会在3‘末端加A，这样你重叠的时候会发生移码突变
关于Touchdown PCR
转载地址3：
优化的方法很多，TD-PCR代表了其中的一种。TD-PCR不应该仅仅被看作一种确定某一特定的PCR最优化循环条件的方法，而是应该看作一种潜在的一步法达到优化扩增的方法。在引物和模板特性未知的情况下，TD-PCR的应用是很有价值的。比如当引物是在氨基酸序列的基础上设计的，或对多基因家族的成员进行扩增，或者尝试做与进化有关的PCR时，也就是说从一个物种中根据同源性用引物去扩增与另一个物种中同源的一个片断时经常出现这种情况。这种情况下，引物和模板的错配可能是由于Tm值太低导致引物与模板在错误位点的结合所致。
热循环编程：
TD-PCR编程的目的是产生一系列退火温度程序降低的循环。退火温度范围的跨度约15度，从此所估计的Tm值高出几度一直到Tm值以下10度左右分布。例如，对于引物-
模板间的Tm值计算为62度时，热循环的设置是从65—50之间，每一次循环比上一次的退火温度降低1度，随后在50度进行15个循环。
对于使用简并引物或者含有错配碱基的的引物进行的TD-PCR，程序运行的调整包括降低退火温度范围（例如从50度降至35度），而在最后15个循环中采用50度或更高一些的退火温度（一旦扩增开始，引物会全部补充到新合成的复制子中，会有更高的Tm值，这时低的退火温度则不利于扩增）。
这种试验方法我也是接触不久，如果PCR时按常规方法调整后，依然得不到预想的结果，建议采用TD-PCR，希望能帮你扩增出特异的条带！
其实退火温度的设定是根据自己的情况可以调整的，比如说，60－50这段温度范围可以设5个温度值，60，58，56，54，52，50。前四个每个温度2个循环，最后一个再20－25个循环。我的温度设定一般是上五度和下五度。这是我的经验，不对之处请指正！
我今天在mj
TPC-100的机子上编程，想一个温度两个循环，然后再往下依次降的，可是我的机子好像无法这样设啊。我就只能从65度到55度，每个循环低0.5度，明天P一下，不知道能否出结果。
这种方法不能再老了。
对于普通的PCR仪，可以一个循环一个循环的编程，尽管麻烦一点，但是还是可以实现的。前两天我按这种方法作了一次，也没有出现预期的结果，坚持不懈摸索条件，我想我们一点可以成功的！
偶不觉得这种方法属于新的方法，几年前偶就开始用这种方法了
请问，您用了TD-PCR之后，跑出来的条带比以前好了没。我这几天跑RT-PCR，总是出现两条杂带，尽管不断的提高退火温度，也没有什么改善。想用TD来试试，不知可否
我就做过几次，效果不是很理想，其实他也不容易做，因为他比常规PCR更复杂，需要摸索的条件可能会更多。
转载地址4：
就是退火温度逐渐降低的PCR，设PCR程序的时候，可以将退火设为每个循环-0.5度或更慢的降低。平时我们先用高温扩5~10个循环，再用低温扩增
15~25个循环，这样也是广义上的touchdown。原理就在于，温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率（此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争）。
biobowl解释不错啊程序你可以摸仿一下(由你的引物和基因长度来定): step1 95度 5min step2 95度 2min
step3 65度 2min step4 72度 3min go to step2 3 cycles step5 95度 2min
step6 64度 2min step7 72度 3min go to step5 3 cycles . . . . stepn
95度 2min stepn+1 60度 2min stepn+2 72度 3min go to stepn 15 cycles
step n+3 72度 10min end 注意总cycle数不可以超过30,还有TM值
退火温度TOUCH
DOWN无法改善你扩增效率低的问题，一般用于在杂模板中提高扩增特异性，因为你原来的退火温度肯定不会倒65度，提这么高对扩增效率有什么好处呢？70循环很多TAQ酶的活力都下降了，循环数多了没用，应该从引物和其他的地方找原因扩增效率低应该注意酶、Mg浓度、降低退火温度、延长扩增时间或者做延伸温度TOUCH
UP 讨论这种问题应该提供酶的种类，PCR条件、模板的类型，这样才好分析原因
同意nano的说法。以前我也遇到过同样问题，无论是优化PCR条件还是做touch
down，都没有收到好的结果；后来重新换了引物才做出来。
PCR程序中最重要的就是退火温度了，如果你把所有的退火温度都试了还是扩增效率底或者没有目的片段的话，就要考虑引物的情况了，另外你的目的片段比较长，可以尝试一下用LAtaq去扩增，这个酶扩长片段有优势的，扩增体系按照酶说明书上的体系就可以了
touchdown循环数不要超过35，超过容易出现假阴性
转载地址5：
关于温度梯度PCR和降落PCR的区别：
& 温度梯度PCR是指在退火温度不太明确时，为了找到最优退火温度，在一台PCR仪上同时做多管PCR，每一管放在仪器内不同列（有的是不同行）上，分别进行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分别为50，52，54，56，58，60度），最后看看哪个温度的效果最好。总之是用来进行退火温度优化的。
& 降落PCR是在同一个PCR管内进行PCR，只是每个循环的温度不同（如每个循环降1度）。一般兼并引物用这种方法多些。
降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术：
　设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。
　由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
　例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。
　则：从65℃—&50℃（每2cycles降退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。
　实验中如持续出现假象带（杂带），则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。
PCR经验总结
转载地址6：
primers design
这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件
足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量
b& GC% 40%~~~~60%
c& 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性
d& 避免3'端GC rich,
最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC
&& e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER
&& f. 避免3'端的错配
&& g. 避免内部形成二级结构
&& h. 附加序列(RT site, Promoter
sequence)加到5'端, 在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补 和二级结构是要加上它们
&& i. 需要使用兼并引物时,
要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)
&& j. 最好学会使用一种design software.
PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.
引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的
Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2. stability of primers
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在
-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存
3. optimize
reactants concentration
a. magnesiom ions
&& Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用
并能影响Polymerase的活性一般 的情况下
Mg的浓度在0.5-5mM之间调整同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液
b. 其他的离子
&& NH4+ K+都会影响PCR。增加K+的浓度后,
会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性(stringency).NH4+也有相同的作用.
MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的.当然,
过高的阳离子浓度(KCL&0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性,
当然也就无从谈起PCR了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真没的效率要远远低于Taq
polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用90~92度,
变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性
&&& 50ul PCR
human gDNA 0.1ug-1ug
&&& E.Coli
10ng-100ng
&&& LamadaDNA
&&& Plasmid DNA
0.1ng-10ng
4. termperature
a. denaturation
&& 常规是94度5分钟, GC
Rich的摸板是95度5分钟，除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟,
或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation
b. annealing
&& 重点到了。一般情况下,
是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S,
时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性.
所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险.另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two
5. touchdown
&& 原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子就OK,
ANNEALING TEMP. 55度
&& 72 1min 2cycles
&& 72 1min 2cycles
&& 72 1min 2cycles
&& 72 1min 2cycles
& 72 1min 20cycles
6. hot start
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq
DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq
DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法
过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。
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ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
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Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
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Magnesium wax beads (Stratagene).
象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。还有一种方法是使用inactive DNA
Polymerase.
polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。
7. Booster
&& 我们知道1ug human genomic DNA
大约在3X105幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,
引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个 booster PCR
我一直找不到合适的词来翻译这个booster.具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的
molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平
8. 循环数和长度
&& 确定循环数的基本原理是:
产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造 成ERRORS和非特异性产物的积累 产物的量不够,
优化的方法有:
1.& 增加TEMPLATE
2. 增加循环数
如何确定循环数,有一个方法.做一个PCR体系,40循环,50ul,
分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCR
cycling时在两个温度间变化的速率(ramping
rate).当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地
9. thermal
PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).
&& 附加物或者说enhancer实在是多种多样.
基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配,
增加产物的长度和产量.在GC Rich情况中,
additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配的primer-template
复合物的极大的不稳定,
而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合gradient
pcr选择最优条件.
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dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol (PEG)%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
Taq Extehder (stratagene)
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度
11. Template DNA
preparation
提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE
DNA进行纯化.特别是SDS(&0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行.
可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase
K也要除干净, 不然会降解polymerase.
12. Nested
&& 简单点说 设计两对引物, 一对是长的,
一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量.
而且可以减少非特异性带和错配的情况.
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增加PCR的保真性
POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型：
a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变
b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA
Polymerase
c.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA
Polymerase.可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。
酶的混合物
将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq
DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。
除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。
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