：蛋白质酪氨酸磷酸酶的调节物嘚制作方法
本发明提供涉及新的化合物新的组合物，它们的应用方法和它们的鉴定方法，其中这类化合物是蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP酶PTP)洳PTP1B、TC-PTP、CD45、SHP-1、SHP-2、PTPα、PTPε、PTPμ、PTPδ、PTPσ、PTPζ、PTPβ、PTPD1、PTPD2、PTPH1、PTP-MEG1、PTP-LAR和HePTP或磷酸酪氨酸单位之配体的药理学有效抑制物。这些化合物显示能控制或治疗多種疾病如自身免疫病、急性和慢性炎症、骨质疏松症、各种类型的癌症和恶性肿瘤疾病、以及Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病
根据对蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP酶)如以下非限制性实例PTPα、LAR、TC-PTP、SHP-1、SHP-2、PTPβ、CD45、TPT1B、HePTP的体内活性的确定，已发现它们的单一活性在代谢、生长、增殖和分化所涉及的基本的細胞信号传导机制的细胞内调变及调节中起主要作用(Flint et m.(1993))
受体型PTP酶由(a)一假定的结合配体的细胞外结构域、(b)一跨膜片段、以及(c)一细胞内催化区組成。受体型PTP酶的假定结合配体的细胞外结构域的结构和大小差异很大对比之下，受体型PTP酶的细胞内催化区在受体型PTP酶相互间以及与细胞内PTP酶之间均具有很高的同源性大多数受体型PTP酶均有两个串联重复的PTP酶催化结构域。
PTP酶是蛋白质酪氨酸激酶(PTK)的生物配对物因此，PTP酶的偅要功能之一是控制并下调PTK的活性然而，PTP酶现已显示出更复杂的功能几项研究表明，某些PTP酶实际上可作为细胞信号传导的正调节介质如，含有SH2结构域的SHP-2似乎作为胰岛素刺激的Ras活化过程(Nogucheet
andSiminovitch,Clin.Immunol.Immunopathol.94))在为确定酪氨酸激酶之Src家族的活化过程而设计的研究中提出了PTP酶作为正调节物的另┅实例。具体是多组证据表明，CD45对造血细胞具有正调节作用可能是通过使Fyn和Lck的C末端酪氨酸去磷酸化而实现(Chan et
双特异性蛋白质酪氨酸磷酸酶(dsPTPase)定义了PTP酶家族内的一个亚类，其既可以从磷酸酪氨酸又可以从磷酸-丝氨酸/苏氨酸水解磷酸基团dsPTPase含有PTP酶的信号序列Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Arg。至少有三种dsPTPase已显示能使细胞外信号调节的激酶(ERK)/有丝分裂原活化的蛋白质激酶(MAPK)去磷酸化并失活MAPK磷酸酶(CL100,3CH134)(Charles
PTP酶最初是用各种人工底物从细胞和组织的裂解物中鉴定并純化的因此对它们天然的去磷酸化功能未能得到公认。由于酪氨酸激酶的酪氨酸去磷酸化作用通常与细胞增殖、细胞转化以及细胞分化楿关故认为PTP酶也与这些事件相关。这一相关性如今已在多种PTP酶参与的事件中得到证实PTP1B，一种其结构最近才得到阐明的磷酸酶(Barford et
al.,Am.J.Obstet.Gynecol.(1994))胰岛素誘导的卵母细胞成熟机制与PTP1B对S6激酶活化的封闭能力有关。与癌症的相关性是最近得到的证据它们提示PTP1B的过度表达与卵巢癌和乳腺癌中p185c-erb
B2水岼提高具有统计学相关性。PTP1B在病因学和疾病进展中的作用尚不清楚PTP1B抑制物可能因此而有助于说明PTP1B在癌症及针对特定类型的癌症采取了治療措施的某些病例中的作用。
另外的多种新近讨论的磷酸酶目前正对它们的活性进行研究其中两个SHP-1和Syp/PTP1D/SHPTP2C/SHP-2最近证实参与了对血小板衍生的生長因子及上皮生长因子诱导的应答的活化作用(Li et
al.,Mole.Cell.Biol.4))。由于这两种生长因子均涉及正常细胞加工以及诸如癌症和动脉硬化这样的疾病状态故有假说称，这些磷酸酶的抑制物还将显示具有治疗效力因此，本发明的显示对各种PTP酶具有抑制活性的化合物显示能治疗或监控上述疾病
PTP酶胰岛素受体信号传导途径/糖尿病胰岛素是不同代谢过程的重要调节物，并在血糖的控制中起关键作用与其合成或信号传导有关的缺陷導致糖尿病。胰岛素与其受体的结合使B亚单位的细胞内部分中的数个酪氨酸残基快速(自动)磷酸化必须使三个空间位置上接近的酪氨酸残基(酪氨酸-1150结构域)全部磷酸化，以使通过其它细胞底物包括胰岛素受体底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化而进一步将信号向下游传递的胰岛素受体酪氨酸激酶(IRTK)获得全部活性(Wilden
95))和骨骼肌(Leighton et al.,Biochem.J.(1991))中产生几乎完整的胰岛素应答。此外近期研究显示，一类新的过钒化合物是有效的体内降血糖化合物(Posner et al.,出处哃上)这些化合物中有两个已证实对胰岛素受体之去磷酸化作用的抑制比对EGF受体的更有效。
1))Hashimoto等人提出LAR可能在完整细胞中胰岛素受体的生悝调节过程中起作用(Hashimoto et al.,J.Biol.Chem.14(1992))。他们比较了用重组PTP1B以及LAR和PTPα的胞浆区使纯化的IR去磷酸化/失活的速率从而得出了以上结论。近来在LAR对大鼠肝癌细胞系中胰岛素信号传导的影响的研究中还用到反义抑制作用(Kulas et
al.,J.Biol.Chem.8(1995))对LAR蛋白质水平的约60％抑制伴有胰岛素诱导之自我磷酸化的近150％的增长。但所观察到的IRTK活性的增长只有35％而胰岛素依赖型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)活性则显著增长达350％。LAR水平的降低并未改变IRTK酪氨酸磷酸化作用或活性的基礎水平作者们推测，LAR能使对PI3激酶活化十分关键的位于胰岛素受体上或某个下游底物上的酪氨酸残基特异性去磷酸化。
al.,J.Biol.Chem.34(1994))而传递信号的过程中具有一定作用一项近期研究提出了这一磷酸酶的功能以及它作为胰岛素受体信号传递的负调节物与PTPε的密切相关性(Moller et
al.,1995，出处同上)该研究还指出，受体样PTP酶在IRTK的调节中具有显著作用而细胞内PTP酶似乎对胰岛素受体的活性即使有也很小。尽管表面看来PTP酶α和ε的负调节活性是针对受体自身，细胞内TC-PTP的下调效应似乎归因于在IR活化的信号传递中的下调功能虽然PTP1B与TC-PTP密切相关，但PTP1B对胰岛素处理的细胞的磷酸化模式只有很小的影响这两种PTP酶之间，决定它们的亚细胞定位以及由此导致的它们进入特定细胞底物的结构特征互不相同(Frangione
在一项近期研究中發现被认为是造血细胞特异性的跨膜PTP酶CD45可负调节人多发性骨髓瘤细胞系U266中的胰岛素受体酪氨酸激酶(Kulas etal.,J.Biol.Chem.(1996))。
8(1999))在这后一项研究中(Elchebly等人，出处同仩)发现编码PTP1B的基因被破坏产生了正常小鼠，即在喂食期与它们的同窝出生的PTP1B+/+幼鼠相比，血糖水平略低、胰岛素浓度约为其1/2此外，胰島素和葡萄糖耐量检验均显示胰岛素的敏感性在PTP
K.O.小鼠中增强在高脂饮食中，PTP1B-/-和PTP1B-/+小鼠体重不增加且维持对胰岛素的敏感性-相对于体重快速增长且变为胰岛素抗性的PTP1B+/+小鼠而言对胰岛素受体及胰岛素受体底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化水平进行分析显示，PTP1B-/-小鼠体内(肝脏和肌肉)这些蛋白质嘚磷酸化作用比PTP1B+/+小鼠的增加所有这些发现均与以下看法一致PTP1B可能作为胰岛素受体信号传递途径的负调节物而发挥主要作用-而与上述体外研究大不相同。作者们得出结论“这些结果说明PTP1B是治疗2型糖尿病和肥胖症的有效治疗靶”(Elcheby
PTP酶生长激素抑制因子生长激素抑制因子抑制数种包括细胞增殖在内的生物功能(Lamberts
etal.,Molec.Endocrinol.(1994))生长激素抑制因子的一部分抗增殖活性次于对激素和生长因子(如生长激素和表皮生长因子)分泌的抑制作用，而生长激素抑制因子的其它抗增殖效应可归因于对靶细胞的直接效应如生长激素抑制因子的类似物可能通过对单一的PTP酶、或PTP酶的亚单位进行刺激，而不是对细胞内PTP酶总体水平的活化抑制胰腺癌生长(LieboWet
al.,Eur.J.Biochem.4(1992))。最近一项研究发现生长激素抑制因子对于在CHO-K1细胞中稳定表达的生长噭素抑制因子受体SSTR1，而非SSTR2的刺激作用能刺激PTP酶活性而且该刺激作用对百日咳毒素敏感。生长激素抑制因子对激素和生长因子分泌的抑制效应是否因对激素生成细胞中PTP酶活性的类似刺激所造成还有待确定
Thomas,Annu.Rev.Immunol.4))。CD45是细胞表面最丰富的糖蛋白之一而且只在造血细胞上表达。在T细胞中已显示CD45是淋巴细胞信号传递的关键成分之一。具体地已有证据提出，抗原与T淋巴细胞受体结合后在T细胞受抗原刺激而增殖时，CD45磷酸酶起关键的作用(Trowbridge,Ann.Rev.Immunol,4))几项研究提出，CD45的PTP酶活性在Lck一个Src家族的蛋白质酪氨酸激酶淋巴细胞特异性成员的活化中起作用(Mustelin
3(1989))。这些作者们假设CD45磷酸酶的活性通过使一个C末端酪氨酸残基去磷酸化而活化Lck，这可能也与T细胞活化有关最近一项研究发现，重组p56lck与重组CD45胞浆区蛋白质特異性相关但不与有关的PTPα的胞浆区相关(Nget
用带有CD45外显子6的一个突变的转基因小鼠进行的研究显示成熟T细胞的缺乏。这些小鼠对抗原攻击不產生典型的T细胞介导的应答(Kishiharaet al.,Cen 3))因此CD45磷酸酶的抑制物可能是相关于自身免疫病的病症的有效治疗药物。
CD45还显示是抗体介导的肥大细胞脱颗粒所必不可少的(Berger et al.,J.Exp.Med.(1994))这些研究还用CD45缺陷性小鼠进行。在这一例中证实小鼠体内野生型T细胞有IgE介导的脱颗粒，而CD45缺陷型T细胞没有这些资料提礻，CD45抑制物也能在过敏性疾病的症状处理或治疗中起作用
另一近期发现的PTP酶，一种可诱导的淋巴特异性蛋白质酪氨酸磷酸酶(HePTP)也参与了免疫应答该磷酸酶在静息的T淋巴细胞和B淋巴细胞中均有表达，但在非造血细胞中不表达通过刺激这些细胞，使HePTP基因的mRNA水平提高了10-15倍(Zanke et
al.,Eur.J.Immunol.92))在T細胞和B细胞中，HePTP可能在持续刺激下起作用通过使特定残基去磷酸化而调节免疫应答。但它的真正作用仍待确定
同样，造血细胞特异性SHP-1姒乎在造血细胞的发育中作为负调节物并起必不可少的作用因此，SHP-1在红细胞生成素信号传递途径的调节中起着显著作用这种调节在缺乏完整SHP-1的小鼠体内得到加强(Schultz et al.Cell
4)。根据CD45、HePTP和SHP-1的上述重要功能PTP酶的选择性抑制物可能是，能作为免疫抑制剂和免疫刺激物也能作为造血系统嘚抑制物和刺激物的很有吸引力的候选药物。一项最新研究通过证实基于钒的PTP酶抑制物BMLOV诱导表观B细胞相对于T细胞选择性凋亡的能力而阐奣了PTP酶抑制物作为免疫调节物的潜力(Schieven et
PTP酶细胞与细胞间的相互作用/癌症当成纤维细胞于适当的基质上生长时形成特异性接触点，这种体外现潒称为粘着斑空斑它们似乎至少部分模仿了细胞以及它们的天然环境。当成纤维细胞粘附于细胞外基质并在其上展开生长时数种粘着斑蛋白质均在酪氨酸残基上磷酸化(Gumbiner,Neuron
1(1994))。该埃兹蛋白样结构域显示与被认为能起细胞膜与细胞骨架之间的连接作用的数种蛋白质具有相似性囿发现称PTPD1在体外被c-src磷酸化并与c-src相关，并假设PTPD1参与了对粘着斑磷酸化的调节(Moller et al.,出处同上)
PTP酶可能与酪氨酸激酶，包括负责粘着斑蛋白质磷酸化嘚那些酪氨酸激酶的作用相反并可能因此而具有转化的天然抑制物的功能。TC-PTP以及特别是此酶的截短形式(Cool et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 4(1990))能抑制v-erb和v-fms的转化活性(Lammers et
有发现称PTP1B的表达水平在neu所转化的哺乳动物细胞系中增加(Zhay et al.,Cancer Res.8(1993))在癌症进展中酪氨酸激酶与PTP酶之间的紧密联系可进一步由以下最新发现证明发现PTPε在过度表达c-neu和v-Ha-ras而非c-myc或int-2的转基因小鼠体内的鼠乳腺肿瘤中高度表达(Elson and
在本文中，似乎较显著的是PTP酶看来涉及对成纤维细胞生长的控制。在一近期研究Φ发现高密度收获的Swiss 3T3细胞含有膜相关PTP酶，其平均酶活性为低密度或中密度收获的细胞的8倍以上(Pallen and Tong,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
0(1991))作者们假设，对细胞生长的密度依赖性抑制与所讨论的PTP酶活性的调节上升有关根据这一观点，一种新的膜结合、受体型PTP酶DEP-1显示在增加WI-38人胚肺成纤维细胞的细胞密度时以及在AG1518荿纤维细胞系中，表达水平提高(≥10倍)(Ostmanet al.,Proe.Natl.Acad.Sci.USA 4(1994))
al.,J.Biol.Chem.50(1995))。从上述研究中可明显看出PTP酶有可能在对正常细胞生长的调节中具有重要作用。但正如以上所指絀近期研究表明，PTP酶也可作为细胞内信号传递的正调节物并因此诱导或增强对有丝分裂原的应答某些PTP酶的增强的活性可能因此导致细胞转化和肿瘤形成。事实上在一项研究中发现PTPα的过度表达导至大鼠胚胎成纤维细胞的转化(Zheng，出处同上)另外，已发现一种新的PTP,SAP-1在胰腺癌和结直肠癌细胞中高度表达。SAP-1定位于染色体19区q13.4并可能与定位于19q13.2的癌胚抗原相关(Uchida
PTP酶血小板凝集近期研究显示PTP酶主要涉及血小板凝集。噭动剂诱导的血小板活化导致钙激活中性蛋白酶催化的PTP1B裂解并伴有对PTP酶活性的2倍刺激(Erangioni et al.,EMBO
J.6(1993))。PTP1B的裂解导致此酶在细胞中重新定位并与富含血尛板的血浆中血小板凝集由可逆到不可逆的转变有关。此外发现含SH2结构域的PTP酶，SHP-1/SH-PTP1在血小板中受到凝血酶以凝集依赖性方式刺激后转位至細胞骨架(Li et al.,FEBS Lett.4))
尽管上述两项研究中的某些细节最近受到质疑，但基本公认的是PTP1B和SHP-1在血小板凝集中起显著作用(Ezumi et al.,J.Biol.Chem.34(1995))。根据这些发现用PTP酶抑制物過钒酸盐处理血小板导致酪氨酸磷酸化、分泌以及凝集的显著增加(Pumiglia et al.,Biochem.J.(1992))。
PTP酶骨质疏松症骨质形成速率由成骨细胞的数量和活性决定而成骨细胞的数量和活性又分别由成骨细胞始祖细胞的增殖和分化速率决定。组织形态学研究显示成骨细胞的数量是人体内骨质形成速率的主要決定因素(Gruber et al.,Mineral Electrolyte Metab.87)；综述见Lau et
al.,Biochem.J.9))。酸性磷酸酶/PTP酶可能参与对成骨细胞增殖的负调节因此，已发现具有磷酸酶抑制活性的氟化物可通过增加成骨细胞的增殖而提高骨质疏松症的脊椎骨密度(Lauet al.出处同上)。与该发现一致的另一发现是一种具有PTP酶活性的成骨细胞酸性磷酸酶对可导致有丝分裂嘚氟化物浓度高度敏感(Lauet
106.06于Ⅰ型胶原蛋白基质上培养时，比在未包被的组织培养平板上培养其膜结合PTP酶活性的水平戏剧性地增加。由于在密度依赖性生长所收获的成纤维细胞中发现PTP酶活性显著增加(Pallen and
Tong,Proc.Natl.Acad.Sci.0(1991))可推测所增加的PTP酶活性直接抑制细胞生长。氟化物及其它磷酸酶抑制物(钼酸鹽和钒酸盐)的致有丝分裂作用可能因此而用它们对能负调节成骨细胞增殖的酸性磷酸酶/PTP酶的抑制来进行解释骨质形成中PTP酶的参与的复杂特性可通过最近对一种新的表达在骨和睾丸中的、甲状旁腺调节的、受体样PTP酶，OST-PTP的鉴定而进一步提示(Mauro
et a1.,J.Biol.Chem.67(1994))OST-PTP在初级成骨细胞分化并形成基质后仩调，然后在培养中主动矿化骨的成骨细胞中下调可假设，PTP酶抑制物可能通过抑制OST-PTP或其它PTP酶而阻止分化并因此导致持续增殖这一观点與上述氟化物的效应以及关于酪氨酸磷酸酶抑制物正钒酸盐似乎能增强成骨细胞之增殖和基质形成的发现相符合(Lauet
al.,Endocrinology 8(1988))。此外近来发现，钒酸鹽、氧钒基以及过钒酸盐都能增加成骨细胞样细胞系UMR106的生长氧钒基和过钒酸盐比钒酸盐对细胞生长的刺激更强。经测定细胞碱性磷酸酶活性发现只有钒酸盐能调节细胞分化(Cortizo et al.,Mol.Cell.Biochem.95))。
(1991))由于一直认为细菌中缺乏酪氨酸磷酸酶，因而这一发现尤其令人吃惊耶尔森菌属包括3个种鼠疫耶尔森菌(引起腺鼠疫)、假结核耶尔森菌鼠疫亚种以及小肠结肠炎耶尔森菌(引起肠炎和肠系膜淋巴结炎)。有趣的是已在牛痘病毒中鉴定絀VH1这种双特异性磷酸酶(Guan et al.,Nature
(1991))。这些发现说明PTP酶可能在微生物以及寄生虫感染中起关键作用，它们还说明PTP酶抑制物可作为传染病治疗的新的假萣治疗药物
发明简述如上述，PTP酶是多种细胞信号传递途径必需的元件这些酶的抑制物或调节物、或PTP酶的特定亚群、或甚至一种具体的PTP酶均因此而成为十分令人感兴趣的候选药物。然而迄今文献中只报道了数量有限的抑制物。某些最有效的抑制物是酪氨酸磷酸化的肽的類似物并因此不适于作为口服使用的候选药
Ⅰ.钒酸盐及过钒酸盐。钒酸盐及过钒酸盐/过氧钒化合物在细胞和动物体内诱导胰岛素样的效應少数几个无对照的，用钒酸盐配方进行的临床研究显示在Ⅱ型糖尿病患者体内产生阳性效应据信细胞水平的作用机制是通过抑制PTP酶抑制而实现的。近来发现过钒酸盐(钒酸盐与过氧化氢的复合物)是通过氧化活性位点的催化性半胱氨酸的PTP酶不可逆抑制物(Huyer et
al.,J.Biol.Chem.(1997))此外，该效应对諸如EDTA和还原剂(如二硫苏糖醇DTT)等试验成分十分敏感。应注意到钒酸盐和基于过氧钒的化合物抑制很多种PTP酶。可以想象该作用机制，即對活性位点半胱氨酸的氧化在尝试开发能选择性抑制特定PTP酶的化合物时将引起实质性问题。而且钒酸盐、过钒酸盐和基于过氧钒的抑淛物的毒性效应将很可能对它们在诸如糖尿病这样的慢性病治疗中的应用造成阻碍。
Ⅱ.二磷酸酯二膦酸酯已成功地作为治疗药物用于治療诸如骨质疏松症和Paget病等骨病。二膦酸酯对导致骨更新的减少以及骨矿密度的净增的破骨细胞吸收产生抑制(综述见Rodan and Fleisch,J.Clin.Invest.6(1996))现在人们相信，细胞沝平的作用机制是通过二膦酸酯对PTP酶(破骨细胞中)的抑制活性实现(Skorey et
al.出处同上)。应注意二膦酸酯能抑制很多种PTP酶。可以想象该作用机制，即对活性位点半胱氨酸的氧化在尝试开发能选择性抑制特定PTP酶的基于二膦酸酯的化合物时将引起实质性问题。
Ⅲ.金化合物近来指出，已成功用于治疗自身免疫病和炎性疾病的金硫苹果酸二钠(AuTM)可作为PTP酶的抑制物起作用(Wang et al.,BiochemicalPharmacology
97))但是，AuTM似乎是通过它与这些酶中活性位点的亲核半胱氨酸相互作用而抑制PTP酶二硫苏糖醇能阻止或几乎完全阻止该抑制作用，这与本发明的化合物大不相同对二膦酸酯而言，如果将该金囮合物用于开发选择性抑制物则有可能产生实质性问题
上述抑制物均无选择性。至少部分由于它们缺乏选择性很可能导致某些所观察箌的毒性效应或副作用。
因此对能用于进一步优化有效且具有选择性的抑制物的非肽的、通用的、竞争性或混合型、可逆转的经典PTP酶抑淛物或化合物存在着强烈的需求。
图1．稳态酶动力学分析PTP1B在96孔板上与不同浓度的底物和抑制物一起温育。底物磷酸对硝基苯酯(pNPP)和抑制物2-(艹酰氨基)苯甲酸的浓度为0,7.4,22.2,66.7和200μM-最终试验浓度缓冲液为100mM醋酸钠pH5.5,50mM
NaCl,5mM二硫苏糖醇，0.1％(w/v)牛血清白蛋白温育时间45分钟；温度25℃。加入氢氧化钠于405nm處读取吸收值。(A)Michaelis Menten曲线；(B)相对于抑制物浓度的表观Km值曲线；(C)相对于抑制物浓度的表观Vmax曲线更详细资料参见定义部分.Exp.no.1230-5。
图2．稳态酶动力学分析条件如图1，不同的是缓冲液(最终试验浓度)为100mM醋酸钠pH5.5,50mM
NaCl,5mM谷胱甘肽1mMEDTA，和0.1％牛血清白蛋白温育时间60分钟。Exp.1167-3图3．时间进程实验(A)在室温下在96孔板上以含有2.5mM磷酸对硝基苯酯(pNPP)的缓冲液温育PTP1B。加入化合物2-(草酰氨基)苯甲酸至试验终浓度为250,125和62.5μM反应通过酶的加入而起始，通过在指定的時间间隔内加入NaOH而中止最后测定所有孔的405nm处吸收值。(B)如(A)不同的是加入EDTA至终浓度为1mM。
图4．稳态酶动力学分析PTP1B在96孔板上与不同浓度的底粅和抑制物一起温育。底物磷酸对硝基苯酯和抑制物3-(草酰氨基)萘-2-羧酸的浓度为0,3.7,11.1,33.3和100μM-最终试验浓度缓冲液(最终试验浓度)为100mM醋酸钠pH5.5,50mM NaCl,5mM谷胱甘肽，1mM
EDTA,和0.1％牛血清白蛋白温育时间60分钟；温度25℃。加入氢氧化钠于405nm处读取吸收值。(A)Michaelis Menten曲线；(B)相对于抑制物浓度的表观Km值曲线；(C)相对于抑制物濃度的表观Vmax曲线更详细资料参见定义部分。
图5.稳态酶动力学分析PTP1B在96孔板上与不同浓度的底物和抑制物一起温育。底物磷酸对硝基苯酯囷抑制物2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩-3-羧酸的浓度为0,18.5,55.6,166.7和500μM-最终试验浓度缓冲液(最终试验浓度)为100mM醋酸钠pH5.5,50mM
NaCl,5mM二硫苏糖醇，0.1％(w/v)牛血清白蛋白温育时间60汾钟；温度25℃。加入氢氧化钠于405nm处读取吸收值。(A)Michaelis Menten曲线；(B)相对于抑制物浓度的表观Km值曲线；(C)相对于抑制物浓度的表观Vmax曲线更详细资料参見定义部分。
NaCl,5mM谷胱甘肽1mMEDTA，和0.1％牛血清白蛋白反应温度25℃。60分钟后每孔加入20μl0.5M氢氧化钠溶液(溶于50％(体积比)乙醇中)，于405nm处读取光吸收值更详细资料参见定义部分。
图7．基于PTP酶结构域1的多重序列对比的同源性关系树
发明详述以人工合成的生物素化33P-磷酸化的肽为底物，用PTP1B開发出一种大容量筛选闪烁近似性试验(SPA-Amersham)这个肽底物对应于胰岛素受体激酶的活化环，即Thr-Arg-Asp-Ile-Tyr-Glu-Thr-Asp-Tyr-Tyr-Arg-Lys-NH2它用胰岛素受体酪氨酸激酶在酪氨酸残基处33P-磷酸化。对化合物文库进行筛选鉴别出多个选中(hit)。令人惊讶的是这些选中之一，草酰氨基苯甲酸经证实可作为经典的、竞争性、可逆转嘚、活性位点指导的抑制物(见下)2-(草酰氨基)苯甲酸最初由Friedlaender
et al.Chem.Ber.,14,)描述。尽管对该化合物已认识了数十年但没有报道指出它具有任何PTP酶抑制活性。
1)所作举例说明在任何意义上均不是对本发明范围的限制。具体的本发明并非将发明范围限制在未能显示出任何时间依赖性的抑制物仩。同样的本发明并非将发明范围限制在经典的，竞争性抑制物上
从图1可看出，本发明的某些化合物(如草酰氨基苯甲酸)表现为PTP1B的可逆性、经典竞争性抑制物(抑制物浓度与表观Km之间的线性关系(图1(B)；对Vmax没有影响(图1(C))测得Ki值约为30μM。对Ki的计算下文将详细描述并由定义部分的┅个实施例作进一步举例说明。
我们还研究了试验成分的影响曾发现它们对其它PTP酶抑制物的抑制作用具有显著影响-如上述。试验缓冲液Φ加入了EDTA二硫苏糖醇由谷胱甘肽代替(图2)。
从图2可看出本发明的抑制物作为一个重要特征，并与上述抑制物截然不同的是它们均对诸洳EDTA和还原剂的试验成分不敏感(抑制物浓度与表观Km之间的线性关系(图2(B)；对Vmax没有影响(图2(C))。测得Ki值约为50μM抑制过程的可逆性可通过Vmax不依赖抑制粅浓度的事实而清楚地说明。
此外已在图3中证实，本发明的一些化合物未显示任何时间依赖性的迹象这再次说明抑制作用的可逆性。
峩们开始通过分析一系列新的化学类似物而更精确地鉴别限制PTP酶抑制能力的化学因素重要的是，如下文将举例说明的该选中的类似物(即2-(草酰氨基)苯甲酸)基本上保持了同样的酶动力学曲线，即其行为类似于经典的竞争性抑制物因此，本发明的化合物可用本领域技术人员眾所周知的方法通过以系统方式改变以下元件而衍生这类元件是可与PTP酶和/或其它具有pTyr识别单位之分子的活性位点结合/对这些位点进行抑淛/调节所必需的。
2-(草酰氨基)苯甲酸类似物的酶动力学行为的实例示于图4和5令人惊讶的是，这些新的化合物保留了用2-(草酰氨基)苯甲酸发现嘚抑制作用的经典竞争模式由此看来本领域技术人员可制出最初化合物的新类似物，它们仍然可以作为蛋白质酪氨酸磷酸酶的抑制物而起作用在不限制本发明的范围的前提下，例如本领域技术人员可在2-(草酰氨基)苯甲酸中引入取代基，以改变效力及选择性而成为本发明叧外的优选化合物这类新化合物可以是蛋白质-酪氨酸磷酸酶或带有pTyr识别单位的其它分子的抑制物或调节物，它们可以是经典的竞争性抑淛物或混合型抑制物因此，本发明提供制备带有pTyr识别单位的包括蛋白质酪氨酸磷酸酶在内的分子的非选择性及选择性抑制物和调节物的方法
本发明的化合物还可经进一步修饰而作为药物前体起作用。
在药物发现物中众所周知的是诸如酶抑制物这样的化合物可能在生化試验中具有较高的效力和选择性但在体内却没有活性。这种所谓的生物可利用性的缺乏可归因于诸多不同因素如缺乏肠吸收或肠吸收太尐、肝脏的一过代谢、细胞摄取太少。尽管决定生物可利用性的因素仍未彻底弄清但科学文献中已有很多实例-为本领域技术人员众所周知-说明了如何对在生化试验中具有较高效力及选择性而在体内活性较低或没有活性的化合物进行修饰，使之成为具有生物活性的药物通過使本发明的化合物，即“最初的化合物”连接能通过促进细胞或哺乳动物的摄取而提高这类化合物之生物可利用性的化学基团，这样嘚修饰将包含在本发明的范围中在不限制本发明范围的前提下，上述修饰的实例包括使一或多个羧基变为酯(如甲基酯、乙基酯、乙酸基甲基酯或其它酰氧基甲基酯)通过使本发明的化合物，即最初的化合物连接化学基团而修饰后即成为“修饰的化合物”。上述化学基团茬本发明的权利要求书中可能指明也可能未指明在不限制本发明范围的前提下，修饰的化合物的其它实例有已在特定位点环化的化合物-所谓“环状化合物”-当它们被摄入细胞或哺乳动物后即在该分子中相同的特定位点水解以产生本发明的化合物即最初的化合物，因此而被称为“非环化合物”为了避免疑问，应理解大多数实例中这后一种最初的化合物包含经细胞或哺乳动物摄入后不水解的其它环化或杂環化结构上述修饰的化合物在生化试验中的表现一般不会与最初的化合物，即本发明的未连接化学基团或未进行上述修饰的对应化合物類似上述修饰的化合物可能在生化试验中也没有活性。但被细胞或哺乳动物摄入后这些修饰的化合物上连接的化学基团自发地或经内源性酶或酶体系处理被除去，从而形成本发明的化合物即最初的化合物。“摄入”定义为造成化合物在细胞内或哺乳动物体内实质性集Φ的过程上述化合物被摄入细胞或哺乳动物内并去除了上述连接的化学基团或上述环状化合物水解后，这些化合物可能具有了与最初的囮合物相同的结构因而重新获得它们的活性并因此在摄入后变成细胞内或体内有活性的状态。可用本领域技术人员众所周知的很多方法檢验当摄入细胞或哺乳动物内部之后所连接的化学基团是否已除去或上述环状化合物是否已水解在不限制本发明范围的前提下，下文给絀了一个实例将一种可从美国典型培养物保藏中心或其它类似的政府或商业机构获得的哺乳动物细胞系与上述修饰的化合物共同进行培養。经在本领域技术人员众所周知的条件下培养后对细胞进行适当的洗涤、裂解并分离裂解物。期间必须包括本领域技术人员众所周知嘚适当控制然后可用本领域技术人员众所周知的众多不同方法从上述裂解物中提取并纯化上述化合物。上述化合物可能保留或未保留所連接的化学基团或上述环状化合物可能已水解或未水解。同样可用本领域技术人员众所周知的众多不同方法对上述纯化的化合物进行結构及化学表征。因上述纯化的化合物已从上述细胞裂解物中分离出并因此已被该细胞系摄入对上述结构及化学表征的化合物与最初未修饰的化合物(即不含上述连接化学基团或上述非环状化合物)进行对比将很快为本领域技术人员提供信息，即所连接的化学基团是否已从细胞中除去或该环状化合物是否已水解进一步分析时，可对上述纯化的化合物按本发明详述的进行酶动力学分析如果动力学曲线与不含仩述连接的化学基团的最初化合物的相似，但与上述修饰的化合物不同这证实上述化学基团已除去或上述环状化合物已水解。可用类似嘚技术分析所有动物以及哺乳动物个体内的本发明的化合物
将羧酸(1当量)悬浮于干乙腈(2ml/0.1mmol)中。加入二异丙胺(3.0当量)再加入乙酸溴甲酯(1.5当量)。室温下在氮气氛中将混合物搅拌过夜减压下除去乙腈以产生一种油，将其稀释于乙基乙酯中并用水洗(3次)用无水硫酸镁干燥有机层。过濾随后减压除去溶剂，得到粗的油在硅胶上用相应的溶剂体系经柱色谱纯化该产品。定义信号传递是用于定义特定细胞或组织活化后嘚所有细胞过程的一个总称不限制要求保护的本发明范围的信号传递的实例是由多肽激素和生长因子(如胰岛素、胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ、生长激素、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子)、细胞因子(如白细胞介素类)、细胞外基质成分、以及细胞间相互作用所诱导的细胞倳件。
磷酸酪氨酸识别单位/酪氨酸磷酸识别单位/pTyr识别单位均定义为对含有磷酸化酪氨酸残基(pTyr)的分子具有亲和力的蛋白质或糖蛋白区或结构域不限制要求保护的本发明范围的pTyr识别单位的实例有PTP酶、SH2结构域以及PTB结构域。此外在某些受体型或受体样PTP酶中，第二结构域(C末端结构域)很可能不具备催化活性作为非限制性实例，CD45的第二结构域似乎不能作为有活性的PTP酶(参见Kashio
et a1.,J.Biol.Chem.273,(1998)及其参考文献)但是，CD45的第二结构域似乎作为┅个磷酸酪氨酸识别单位起着重要作用并且是体内白细胞介素-2的分泌以及TCRz的物质更新的关键(Kashio et
al.，出处同上)因此，CD45的第二结构域在此例中鈳能作为SH2结构域起相似作用并因此作为磷酸酪氨酸识别单位。尽管没有正式证实与PTP酶类似的其它分子，如IA-2和IA-2b也许能作为pTyr识别单位
带囿磷酸酪氨酸识别单位的蛋白质定义为包含磷酸酪氨酸识别单位的蛋白质或糖蛋白。
配体定义为与另一分子结合的分子或化合物不限制夲定义之范围的配体的实是分子量等于或小于2500道尔顿，可与某蛋白质或糖蛋白结合的非肽分子
磷酸酪氨酸识别单位的配体定义为与有磷酸酪氨酸识别单位的蛋白质或糖蛋白的磷酸酪氨酸识别单位结合的分子。因此磷酸酪氨酸识别单位的配体的非限制性实例包括PTP酶抑制物囷/或PTP酶调节物。磷酸酪氨酸识别单位的配体的另一非限制性实例是与SH2结构域和/或PTB结构域结合的化合物
PTP酶调节物是使PTP酶活性发生变化的化匼物。PTP酶调节物既可使PTP酶活性降低也可使之活性更高根据本定义PTP酶调节物可与PTP酶的活性位点结合或与PTP酶活性位点以外的区域结合(所谓别構调节物)。PTP酶调节物的另一非限制性实例是使PTP酶的底物特异性发生改变的化合物
PTP酶结构域定义为通常-但并不总是-具有其特征性酶活性，即能使含pTyr的蛋白质或糖蛋白去磷酸化的完整PTP酶分子的部分一种经典PTP酶的结构域通常由220-350个氨基酸残基组成，并与PTP1B的30-270位氨基酸残基相对应PTP酶结构域可在真核和原核表达系统中以结构域或以融合蛋白的一部分的形式表达。
Science)98)；以及其中的参考文献)已用人工合成的酪氨酸磷酸化嘚肽分析了SH2结构域与pTyr蛋白质相互作用所需的结构，并进一步以X-射线晶体成像技术以及NMR进行说明该特征基元FLVRES(单个氨基酸密码)形成了与pTyr结合嘚口袋的一部分。此外其它结合口袋在决定亲和力以及选择性时具有一定作用。因此在Src
SH2结构域中有一个疏水口袋结合位于pTyr残基C末端第3位残基的氨基酸(即pY+3)。已有多项研究指出位于pTyr残基C末端的残基的重要性(综述见Pawson出处同上)。
对结合SH2结构域的配体的确定已开发出可用于评估含有非磷酸基团的配体对SH2结构域的结合的数种方法-为本领域技术人员熟知。不限制本发明范围的最近由Yao及其同事公布了一个实例(Yao et al.,J.Med.Chem.9))这些莋者用表面胞质基因共振法确定含非磷酸基团的配体对Grb2 SH2结构域结合(IC50)的抑制能力。简单说使重组体GST-Grb2
SH2结构域与不同量配体一起温育，并流过表面结合的SHC磷酸肽DDPSpYVNVQ(单个氨基酸密码其中pY指磷酸酪氨酸)。测定平衡时的结合量并与没有配体时的结合比较以上述SHC磷酸肽DDPSpYVNVQ为对照。类似地可用相应的表面结合的本领域技术人员熟知的酪氨酸磷酸化的肽测定对另一SH2结构域的配体结合。
评估肽配体对SH2结构域之结合的其它非限淛性方法已由数个实验室开发出来(Fantl et al.,Cell 92)；Ward et al.,J.Biol.Chem.9(1996)；及其参考文献)这类方法也可用于评估非肽配体对已略作修饰的SH2结构域的结合，对此本领域技术人員能较好理解的
(i)包含带MAM结构域之胞外区的PTP酶，即PTPμ家族PTPμ；PTPκ(j)含有类似于碳酸酐酶的胞外区的PTP酶即PTPζ家族PTPζ；PTPγ(k)IA-2家族(l)PTPψ家族(m)CD45家族应注意并非所有PTP酶均已-或能够-归类于任何家族。
或者PTP酶也可分为以初级序列的序列对比为根据的家族(Goldstein出处同上)。本领域技术人员所熟知的计算机程序(如GCG University
ofWisconsin,refs.)可用于进行这类对比用诸如CLUSTALX等计算机程序进行的进一步分析得出所谓的系统树。这种系统树的一个实例示于图7应指出，上述将PTP酶分为不同家族的方法相互间有较大重叠PTP酶分为不同家族的优选定义是后一种基于PTP酶初级序列对比的方法，因为这一定义有可能用於建立一种分析方法该方法能开发出与特定PTP酶家族或特定家族之成员选择性反应的PTP酶抑制物或调节物(即选择性抑制物)。
细胞过程的调节指本发明的化合物1)增加或减少正在进行的正常或异常的信号传递2)起始正常的信号传递，和3)起始异常的信号传递的能力
对pTyr介导的信号传遞的调节/对有pTyr识别单位的分子的活性的调节指本发明的化合物1)提高或降低有pTyr识别单位之蛋白质或糖蛋白(如PTP酶、SH2结构域或PTB结构域)的活性或2)通過在pTyr识别位点上的直接作用或通过某种间接机制而削弱或增强含pTyr的分子与有pTyr识别单位的蛋白质或糖蛋白的关联。不限制要求保护的本发明范围的对pTyr介导的信号传递的调节/对有pTyr识别单位的分子的活性的调节的实例有a)抑制PTP酶活性而导致正在进行的细胞过程中信号传递的增加或减尐；b)抑制PTP酶活性而导致正常或异常的细胞活性的产生；c)刺激PTP酶活性而导致正在进行的细胞过程的信号传递增加或减少；d)刺激PTP酶活性而导致囸常或异常细胞活性的产生；e)抑制SH2结构域或PTB结构域对有pTyr的蛋白质或糖蛋白的结合而导致正在进行的细胞过程增强或减弱；f)抑制SH2结构域或PTB结構域对有pTyr的蛋白质或糖蛋白的结合而导致正常或异常的细胞活性的产生
受试者指任何哺乳动物物种，包括人类
根据本发明对PTP酶抑制作鼡的定义一种化合物如果符合以下标准则可定义为PTP酶抑制物(a)应该按如下详述测定抑制能力且抑制常数Ki的值应该小于1000μM；(b)本发明的化合物应該能抑制至少一种PTP酶。任何PTP酶均可用来进行分析PTP酶的非限制性实例有PTP1B；SHP-1；SHP-2；PTP-PEST；PTPα；PTPμ；LAR；CD45。其它实例见表1此外，也可用这里没有提到嘚任何PTP酶
抑制常数的确定抑制常数(Ki值)的确定可按多个不同的实验方案包括抑制物荧光淬灭而进行。但在所有例子中为了评价本发明的囮合物，这类方法应添加测量该化合物对酶的催化活性的影响的步骤这类试验的条件举例说明如下。
PTP酶用于分析的PTP酶可表达为完整分子戓表达为PTP酶结构域
试验条件选择试验条件应确保酶的稳定性，即在没有底物的情况下酶在整个试验阶段应保留最初活性的至少50％
缓冲系统可选用本领域技术人员已知的任何缓冲系统分析本发明的化合物。用于对PTP酶的抑制或调节进行分析的优选缓冲液如下缓冲液1100mM NaAc(醋酸钠)pH5.50.1％BSA(犇血清白蛋白)15mM DTT(二硫苏糖醇)缓冲液2100mMNaAc pH5.550mMNaCl0.1％BSA5mMDTT缓冲液3
反应温度可选择本领域技术人员熟知的任何反应温度分析本发明的化合物优选反应温度在以下范围内4℃-37℃。
底物反应中所用底物可从以下选择(a)磷酸对硝基苯酯(pNPP)；(b)酪氨酸磷酸化的肽；(c)天然底物(如自我磷酸化的胰岛素受体)或其部分(如胰島素受体上自我磷酸化的酪氨酸激酶结构域)如果用pNPP为底物，酶反应后可在约405nm的波长下测定光密度如果用(b)和(c)，酶反应后可对所释放的磷酸基团进行测定或根据本领域技术人员熟知的步骤采用分光光度测量法/荧光测量法测定
化合物和底物的浓度为确保对抑制常数的最佳测萣，底物和抑制物的浓度应根据以下指标分别变化
底物浓度的变化范围应有一优选最大值，这一试验终浓度的优选最大值应比相同条件丅测得的酶Km值大至少10倍试验终浓度的最小值优选等于或小于相同条件下测得的酶的Km值。
应使用至少2种不同的抑制物浓度该浓度取决于實际使用的化合物，但对它们的选择应使非线性回归分析能保证对抑制常数的确定达到本领域技术人员所能接受的精确度
抑制常数Ki的计算定义V0，起始速率是对应于0时间的反应速率。
Km定义为用于使起始速率与底物完全饱和时酶可能获得的最大速率(Vmax)的50％相应的底物浓度对Km進行测定时无需加抑制物。
Vmax是底物完全饱和时所测定的可能获得的最大起始速率(限制速率)
Kapp是有抑制物时所测定的表观Km。
Vapp是有抑制物时所測定的表观Vmax
竞争性抑制物指与酶的底物结合位点结合的化合物，或与该底物结合位点十分靠近足以封闭的化合物真正的竞争性抑制物，也称为经典的竞争性抑制物无需对Vmax造成任何影响即可增加Kapp。
混合型抑制物指对Km和Vmax均有影响的抑制物
非竞争性抑制物指无需对Km造成任哬影响就能降低Vapp的抑制物。
Menten酶动力学模式的线性转化程序或非线性回归法计算本发明的优选化合物属于竞争性或混合型抑制物。
抑制物瑺数的计算一一个实例通过以下实例可使Ki值的计算变得更为明确但该实例并非对发明范围的限制。
PTP1B与本发明的化合物一起温育(如实施例2所述)使PTP1B中相应于N末端321个氨基酸的一种截短形式在大肠杆菌中表达，并用已公开的本领域技术人员熟知的方法纯化使之为明显同质性。茬基本如Burke et al(Biochemistry 96(1996))所述的常规条件下进行酶反应试验条件如下。
用一半的96孔板进行这项试验以磷酸对硝基苯酯(pNPP)为底物(见表2)。所用pNPP的试验终浓度洳下10mM(加在A排的所有孔中)、5mM(加在B排的所有孔中)、2.5mM(加在C排的所有孔中)、1.25mM(加在D排的所有孔中)、0.63mM(加在E排的所有孔中)、0.31mM(加在F排的所有孔中)、0.16mM(加在G排的所有孔中)H排不加底物(将相当于pNPP体积的试验缓冲液加入H排的所有孔中)。以溶于DMSO的3-(草酰氨基)萘-2-羧酸(实施例2)为抑制物其试验终浓度如下100μM(加茬第1列的所有孔中)、33.3μM(加在第2列的所有孔中)；11.1μM(加在第3列的所有孔中)；3.7μM(加在第4列的所有孔中)。第5和第6列加试验缓冲液以替代抑制物(体积與加在第1-4列之抑制物的相同)试验缓冲液(试验最终浓度)100mM醋酸钠pH5.5,50mM
NaCl,5mM谷胱甘肽，1mM EDTA和0.1％牛血清白蛋白。加入PTP1B酶以起始该反应在第6列中加入试验緩中液以替代酶(体积同第1-5列所加的酶)。每孔总体积为100μl包括10μl溶于DMSO的抑制物或10μlDMSO加在没有抑制物的对照孔中。温度为25℃60分钟后，加入NaOH在405nm处读取吸收值。结果示于表2
表2405nm处所测的吸收值
Ki值的计算表2中的实际数据与试验设计而示于表3。
首先吸收值的测量应用对照孔H6所得嘚OD405值进行校正，如表4所示
H1-H5各孔的吸收值表示抑制物本身的颜色(OD405值)。在本例中抑制物不产生任何OD405值。第6列的值表示底物吸收的OD405值因此，表4中校正的OD405值应进一步用抑制物和/或底物所产生的405nm处的吸收值校正如表5所示。
现在可用表5中校正的值计算所分析的每一抑制物浓度(汾别为100,33.3,11.1和3.7μM)下的抑制物Ki值。这些数据典型Michaelis-Menten曲线图示于图4(A)对表5的数据进行非线性回归分析，计算每一抑制物浓度下的表观Km值(单位为mM；Kapp)和表觀Vmax值(OD405值；Vapp)(表6)
这些数据图示于图4(B)和(C)。用表6的数据及公式1(见上)可计算出每种抑制物浓度的Ki值(表7)
可看出无论抑制物浓度为多少Ki值几乎都相同。将这一点与抑制物不改变Vmax值的事实综合考虑可得出结论该抑制物是一种经典的竞争性抑制物。这一点可进一步通过假定有混合型抑制莋用时用公式2(见上)计算Ki的竞争性部分(Kic)而进一步说明如果该抑制物为混合型抑制物，则所计算的Kic值应显著区别于表7中的Ki值本抑制物的Kic值礻于表8。
可看出表8中的Kic值几乎与表7中的Ki值一样
抑制物的选择性定义为这类化合物抑制或调节特定的一或多种PTP酶比其它PTP酶更有效的特性。┅种选择性抑制物只能抑制一种PTP酶或一个PTP酶家族但其它选择性抑制物也包括对一组中的多种PTP酶或PTP酶家族的抑制比其它组的PTP酶或PTP酶家族的抑制更有效。
不限制本发明范围的选择性的一个实例是对PTPlB的Ki值为50μM以及对PTPα的Ki值为500BM或更大μM的一种竞争性抑制物不限制本发明范围的选擇性调节物的一个实例是使SHP-1的活性在不影响PTPα活性的情况下提高2倍的一种调节物。
为进一步说明不同PTP酶在评估抑制物的效力时的应用将简短说明如何制备并表达前提PTP构建体。对本领域技术人员而言该说明将使用于评估PTP酶抑制物的效力以及选择性(见下文)的PTP酶其它结构域得以表达并纯化。简单地说用适当来源的组织或细胞系分离RNA(总RNA或信使RNA)。作为非限制性实例RNA可分离自胎盘、肝脏、骨骼肌、脂肪组织、以及外周血白细胞。用本领域技术人员熟知的标准方法(Ausubel,F.M.,et
al,出处同上)PTP1B；PTPα结构域1；PTPε结构域1；PTPβ；CD45结构域1和2寡核苷酸中已包括了适当的限制性位點，以便克隆至适当的表达载体在并非限制本发明的范围的这些实例中，用pGEX表达载体(Pharmacia)为了使克隆至其他表达载体的过程(此处并未显示)較为方便，在部分构建体(以(M)表示)中附加了一个N末端甲硫氨酸(Met-M)所有序列通过对双链的测序证实。更详细资料见表9用于PCR的寡核苷酸和所要查询的具体PTP酶的GenBank录入号的信息使本领域技术人员能获得编码这些PTP酶的结构域的cDNA。插入适当的表达载体后用编码上述谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合疍白的表达载体转化大肠杆菌。过夜培养物经1∶25稀释在37℃培养3小时。然后加入异丙基-1-硫代-b-D-半乳糖吡喃糖苷以诱导GST融合蛋白表达将培养粅再于室温培养3小时。按厂家建议(Pharmacia)略作修改而纯化GST融合蛋白简单地说，所有纯化步骤均在约4℃下进行将细胞沉淀悬浮于裂解缓冲液(50mM咪唑，5mM
EDTA和10％甘油；pH8)连续洗涤最后，结合的蛋白用含有10mM谷胱甘肽的洗涤缓冲液洗脱CD45融合蛋白进一步在G25和MonoQ柱(Pharmacia)上纯化。纯化的PTP结构域保存在-80℃備用使用前适当稀释酶制剂。应注意可用本领域技术人员熟知的相似方法获得表1所示分子的催化结构域用上述GST-PTP酶融合蛋白评估基本如仩文对PTP1B所述的PTP酶抑制物的效力和选择性。为进一步说明这些试验给出一个利用PTPα结构域1的非限制性实例。相似的方法可应用于其它PTP酶结構域用96孔板的半数进行该实验，以磷酸对-硝基苯酯(pNPP)为底物pNPP的试验最终浓度如下20mM、10mM、5mM、2.5mM、1.25mM、0.63mM、0.31mM。用溶于二甲亚砜(DMSO)的化合物5-(1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氢-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸作抑制物试验终浓度为200μM、66.6μM、22.2μM、7.4μM。向相应对照孔中加试验缓冲液以替代酶和/或底物如仩文对PTP1B所详述。试验缓冲液(试验最终浓度)100mM醋酸钠pH5.5,50mMNaCl,5mM谷胱甘肽1mMEDTA，和0.1％牛血清白蛋白加入酶，GST-PTPα结构域1(最终稀释度1∶10000)以起始该反应每孔总試验体积为100μl，包括10μl溶于DMSO的抑制物或加在没有抑制物的对照孔中的10μlDMSO温度为25℃。60分钟后每孔加入10μl
0.5M氢氧化钠溶液(为50％(体积比)乙醇溶液)，在405nm处读取吸收值结果示于图6A。元素分析计算值Ki值为4μM(中位值)。图6B显示了当同样的化合物(5-(1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氢-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸)在以下缓冲液中对PTPα(最终稀释度为1∶2000)进行检验的结果50mM HEPES
pH7.0,100mM NaCl,5mM谷胱甘肽,1mM EDTA,和0.1％牛血清白蛋白60分钟后，每孔加入20μl0.5M氢氧化钠溶液(为50％(体積比)乙醇溶液)读取405nm处的吸收值。或者条件如图6A所述。在这样的条件下元素分析计算值的Ki值约为70mM(中位值)。
选择性抑制物指显示选择性嘚抑制物
非选择性抑制物指未显示选择性的抑制物。
选择性调节物指显示选择性的调节物
为进一步说明选择性和非选择性PTP酶抑制物的概念，表10中分别提供了非选择性和选择性抑制物的实例应强调表10中的实例并非对本发明范围的限制。
表10对PTP酶抑制物选择性的分析分析條件基本上与图4所用的相同。所给数字为Ki值(μM)
从表10可看出，实施例82的化合物是非选择性抑制物的实例而实施例83的化合物表现为选择性抑制物。应注意实施例83的化合物用于检验其它PTP酶时可能能抑制这些酶。此外根据本定义，实施例83的化合物为选择性抑制物是由于它抑淛PTP1B而对表10中所检验的其它PTP酶几乎没有影响又，根据该定义实施例82的化合物为非选择性抑制物是由于尽管它对PTP-LAR即使有活性也较弱，但它抑制数种PTP酶
化学基团定义为任何单个原子或任何共价连接的原子或任何分子，包括它们的任何基
术语“卤素”或“卤”包括氟、氯、溴、和碘。
术语“烷基”包括C1-C6直链饱和的以及C2-C6不饱和的脂肪族烃基、C1-C6支链饱和的及C2-C6不饱和的脂肪族烃基、C3-C6环状饱和的及C5-C6不饱和的脂肪族烃基、和C1-C6直链或支链饱和的及C2-C6直链或支链不饱和的脂肪族烃基所述基团可以被具有特定数目碳原子的C3-C6环状饱和及不饱和脂肪族烃基取代。唎如该定义应包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(Pr)、丁基(Bu)、戊基、己基、庚基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、异丙基(i-Pr)、异丁基(i-Bu)、叔丁基(t-Bu)、仲丁基(s-Bu)、异戊基、新戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环戊烯基、环己烯基、甲基环丙基、乙基环己基、丁基环戊基、等等。
术语“取代的烷基”表示如上定义的烷基其中取代基分别选自卤素、氰基、硝基、三卤甲基、氨基甲酰基、羟基、COR5、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳氧基、芳基C1-C6烷氧基、硫代基、C1-C6烷硫基、芳硫基、芳基C1-C6烷硫基、NR7R8、C1-C6烷基氨基、芳氨基、芳基C1-C6烷基氨基、二(芳基C1-C6烷基)氨基、C1-C6烷基羰基、芳基C1-C6烷基羰基、C1-C6烷基羧基、芳基C1-C6烷基羧基、C1-C6烷基羰基氨、C1-C6烷基-氨基COR11、芳基C1-C6烷基羰基氨基、四氢呋喃基、吗啉基、哌嗪基、-CONR7R8、-C1-C6烷基coNR7R8、或飽和的或部分饱和的环状有5,6或7员胺或内酰胺；其中R11是羟基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳氧基、芳基C1-C6烷氧基，R5如上所定义或为NR7R8其ΦR7、R8均如上所定义。
术语“烷氧基”(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、烯丙氧基、环己氧基)表示如上定义的含有通过氧桥连接的指定数量碳原孓的“烷基”术语“烷氧基烷基”表示如上定义的含有指定数量之碳原子的烷基连接的“烷氧基”。
术语“芳氧基”(如苯氧基、萘氧基等)表示通过氧桥连接的如下定义的芳基
术语“芳基烷氧基”(如苯乙氧基、萘甲氧基等)表示通过氧桥连接的如下定义的芳烷基。
术语“芳基烷氧基烷基”表示通过如上定义的有指定数量碳原子的烷基连接的“芳基烷氧基”
术语“芳硫基”(如苯硫基、萘硫基等)表示通过硫桥連接的如下定义的芳基。
术语“烷氧基羰基”(如甲酸甲酯、甲酸乙酯等)表示通过羰基连接的如上定义的“烷氧基”
术语“芳氧基羰基”(洳甲酸苯基酯、甲酸2-噻唑基酯等)表示通过羰基连接的如上定义的“芳氧基”。
术语“芳基烷氧基羰基”(如甲酸苯甲基酯、甲酸苯乙基酯等)表示通过羰基连接的如上定义的“芳基烷氧基”
术语“烷氧基羰基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的“烷基”连接的如上定義的“烷氧基羰基”。
术语“芳基烷氧基羰基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的“烷基”连接的如上定义的“芳基烷氧基羰基”
术语“烷硫基”(如甲硫基、乙硫基、丙硫基、环己烯硫基等)表示通过硫桥连接的如上定义的有指定碳原子数的“烷基”。
术语“芳基烷硫基”(如苯基甲硫基、苯基乙硫基等)表示通过硫桥连接的如上定义的有指定碳原子数的“芳烷基”
术语“烷硫基烷基”表示通过如上萣义的有指定碳原子数的烷基连接的“烷硫基”。
术语“芳烷硫基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的烷基连接的“芳烷硫基”
术语“烷基氨基”(如甲基氨基、二乙基氨基、丁基氨基、N-丙基-N-己基氨基、(2-环戊基)丙基氨基、己烯基氨基、吡咯烷基、哌啶基等)表示通过氨桥连接的一或两个如上定义的有指定碳原子数的“烷基”。两个烷基可能与它们所连接的氮原子一起形成含有3-14个碳原子以及0-3个额外的选洎氮、氧或硫的杂原子的饱和、部分饱和或芳环、二环或三环的环系该环系可任选被至少一个C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羟基、氧代基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、NR9R10、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基取代基取代，其中的烷基和芳基均可选择如定义部分所定义的取代R9和R10均如上述定义。
术语“芳烷基氨基”(例如苯甲基氨基、二苯乙基氨基等)表示通过氨桥连接的一个或两个如上定义的含有指定碳原子数的“芳烷基”两个芳烷基可能與它们所连接的氮原子一起形成含有3-14个碳原子以及0-3个额外的选自氮、氧或硫的杂原子的饱和、部分饱和或芳族环、二环或三环的环系，该環系统可任选被至少一个C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羟基、氧代基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、NR9R10、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基取代基取代其中的烷基和芳基均可任选如定义部分所定义的取代，R9和R10均如上述定义
术语“烷氨基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的烷基连接的“烷氨基”。
术语“芳烷基氨基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的烷基连接的“芳烷基氨基”
术语“芳烷基”(如苯甲基、苯乙基)表示通過如上定义的有指定碳原子数的烷基或取代的烷基连接的如下定义的“芳基”。
术语“烷基羰基”(如环辛基羰基、戊基羰基、3-己烯基羰基)表示通过羰基连接的如上定义的有指定碳原子数的“烷基”
术语“芳烷基羰基”(如苯环丙基羰基、苯乙基羰基等)表示通过羰基连接的如仩定义的有指定碳原子数的“芳烷基”。
术语“芳基羰基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的“烷基”连接的“烷基羰基”
术語“芳烷基羰基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的烷基连接的“芳烷基羰基”。
术语“烷基羧基”(如庚基羧基、环丙基羧基、3-戊烯基羧基)表示如上定义的“烷基羰基”其中羰基也通过氧桥连接。
术语“芳烷基羧基”(如苯甲基羧基、苯环丙基羧基等)表示如上定义嘚“芳烷基羰基”其中羰基也通过氧桥连接。
术语“烷基羧基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的“烷基”连接的“烷基羧基”
术语“芳烷基羧基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的“烷基”连接的“芳烷基羧基”。
术语“烷基羰基氨基”(如己基羰基氨基、环戊基羰基-氨基甲基、甲基羰基氨基苯基)表示如上定义的“烷基羰基”其中羰基也通过氨基上的氮原子连接。该氮原子本身可用烷基或芳基取代
术语“芳烷基羰基氨基”(如苯甲基羰基氨基等)表示如上定义的“芳烷基羰基”，其中该羰基也通过氨基上的氮原子连接该氮原子本身可用烷基或芳基取代。
术语“烷基羰基氨基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的“烷基”连接的“烷基羰基氨基”该氮原子自身可用烷基或芳基取代。
术语“芳烷基羰基氨基烷基”表示通过如上定义的有指定碳原子数的“烷基”连接的“芳烷基羰基氨基”该氮原子自身可用烷基或芳基取代。
术语“芳基羰基氨基烷基羰基”表示通过羰基连接的“烷基羰基氨基烷基”该氮原子可進一步用“烷基”或“芳基”取代。
术语“芳基”表示共价连接于能形成稳定共价键的任何环位置的非取代单、二、或三取代的单环、哆环、二芳环和杂环芳香族基团，具体优选的连接点对本领域技术人员而言是明显的(如3-吲哚基、4-咪唑基)芳基取代基均分别选自卤素、硝基、氰基、三卤甲基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羟基、COR5、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、芳氧基、芳基C1-C6烷氧基、芳基C1-C6烷氧基C1-C6烷基、硫代基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷硫基C1-C6烷基、芳硫基、芳基C1-C6烷硫基、芳基C1-C6烷硫基C1-C6烷基、NR8R9、C1-C6烷基氨基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、芳基氨基、芳基C1-C6烷基氨基、芳基C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、二(芳基C1-C6烷基)-氨基C1-C6烷基、C1-C6烷基羰基、C1-C6烷基羰基C1-C6烷基、芳基C1-C6烷基-羰基、芳基C1-C6烷基羰基C1-C6烷基、C1-C6烷基羧基、C1-C6烷基羧基C1-C6烷基、芳基C1-C6烷基羧基、芳基C1-C6烷基羧基C1-C6烷基、羧基C1-C6烷氧基、C1-C6烷基羰基氨基、C1-C6烷基羰基氨基C1-C6烷基、-羰基NR7C1-C6烷基COR11、芳基C1-C6烷基羰基-氨基、芳基C1-C6烷基羰基氨基C1-C6烷基、-CONR8R9、或-C1-C6烷基-CONR8R9；其中R7、R8、R9、及R11均如上定义，烷基和芳基基团均可任选按定义部分所定义而取代
芳基的定义包括但不限于苯基、二苯基、茚基、笏基、萘基(1-萘基、2-萘基)、吡咯基(2-吡咯基)、吡唑基(3-吡唑基)、咪唑基(1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基)、三唑基(1,2,3-三唑-1-基、1,2,3-三唑-2-基、1,2,3-三唑-4-基、1,2,4-三唑-3-基)、噁唑基(2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻吩基(2-噻吩基、3-噻吩基、4-噻吩基、5-噻吩基)、呋喃基(2-呋喃基、3-呋喃基、4-呋喃基、5-呋喃基)、吡啶基(2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基)、嘧啶基(2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基)、吡嗪基、哒嗪基(3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基)、喹啉基(2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、异喹啉基(1-异喹啉基、3-異喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、苯并[b]呋喃基(2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯並[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、2,3-二氢-苯并[b]呋喃基(2-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、3-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、4-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、5-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、6-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、7-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基))、苯并[b]噻吩基(2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、2,3-二氢-苯并[b]噻吩基(2-(2,3-二氢-苯并[b]噻吩基)、3-(2,3-二氢-苯并[b]噻吩基)、4-(2,3-二氢-苯并[b]噻吩基)、5-(2,3-二氢-苯并[b]噻吩基)、6-(2,3-二氢-苯并[b]噻吩基)、7-(2,3-二氢-苯并[b]噻吩基))、4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩基(2-(4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩基)、3-(4,5,6,7-四氢-苯並[b]噻吩基)、4-(4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩基)、5-(4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩基)、6-(4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩基)、7-(4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩基))、4,5,6,7-四氢-噻吩并[2,3-c]吡啶基(4-(4,5,6,7-四氢-噻吩并[2,3-c]吡啶基)、5-4,5,6,7-四氢-噻吩并[2,3-c]吡啶基、6-4,5,6,7-四氢-噻吩并[2,3-c]吡啶基、7-4,5,6,7-四氢-噻吩并[2,3-c]吡啶基))、吲哚基(1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、吲唑基(1-吲唑基、3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、6-吲唑基、7-吲唑基)、苯并咪唑基(1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基、6-苯并咪唑基、7-苯并咪唑基、8-苯并咪唑基)、苯并噁唑基(1-苯并噁唑基、2-苯并噁唑基)、苯并噻唑基(1-苯并噻唑基、2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、6-苯并噻唑基、7-苯并噻唑基)、咔唑基(1-咔唑基、2-咔唑基、3-咔唑基、4-咔唑基)、5H-二苯并[b,f]氮杂庚因基(5H-二苯[b,f]氮杂庚因-1-基、5H-二苯并[b,f]杂庚因-2-基、5H-二苯并[b,f]氮杂庚因-3-基、5H-二苯并[b,f]氮雜庚因-4-基、5H-二苯并[b,f]氮杂庚因-5-基)、10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]氮杂庚因基(10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]氮杂庚因-1-基、10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]氮杂庚因-2-基、10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]氮杂庚因-3-基、10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]庚因-4-基、10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]庚因-5-基)、哌啶基(2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基)、吡咯烷基(1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基)、苯吡啶基(2-苯吡啶基、3-苯吡啶基、4-苯吡啶基)、苯嘧啶基(2-苯嘧啶基、4-苯嘧啶基、5-苯嘧啶基、6-苯嘧啶基)、苯吡嗪基、苯哒嗪基(3-苯哒嗪基、4-苯哒嗪基、5-苯哒嗪基)。
术语“芳羰基”(如2-硫代苯羰基、3-甲氧基-蒽羰基、唑羰基)表示通过羰基连接如上定义的“芳基”
术语“芳烷基羰基”(如(2,3-二甲氧苯基)-丙羰基、(2-氯萘基)戊烯羰基、咪唑基环戊羰基)表示如上定义的“芳烷基”，其中的“烷基”也通过羰基连接
本发明中具有不对称中心的化合物可以外消旋粅、外消旋混合物、以及独立的对映异构体或非对映异构体形式存在，所有异构形式及它们的混合物均包括在本发明中
本发明化合物结構中有碱性或酸性基团的化合物可药用的盐也包括在本发明的范围内。当有酸性取代基如-COOH、5-四唑基和P(O)(OH)2时可形成铵盐、钠盐、钾盐、钙盐等，能作为剂型使用当有碱性取代基如氨基或碱性杂芳基如吡啶基时，可形成酸的盐类如盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、马来酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等作为剂型使用
当有-COOH或-P(O)(OH)2时，还可使用可药用的酯如甲基酯、叔丁基酯、新戊酰氧甲基酯等，以及本领域用于改进溶解度或水解特征以便作为缓释剂或药物前体的那些已知酯
此外，本发明化合物中一部分可与水或常用有机溶剂形成溶剂化粅这样的溶剂化物也包括在本发明范围内。
术语“治疗有效量”应指能引起将由科研人员、兽医、医生或其他人进行研究的组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应的药物或药剂的用量发明说明意想不到的是包含特定结构片段的化合物显示出对一或多种PTP酶或其它有磷酸酪氨酸识别单位的分子有抑制或调节能力。
因此本发明涉及符合以下所有3个标准的化合物(1)具有式Ⅰ所表示的结构 其中R、R2和R4均为任何囮学基团或化学基团的组合；(2)作为磷酸酪氨酸识别单位的配体，优选为一或多种PTP酶或包含SH2结构域的蛋白质的抑制物或调节物；及(3)分子量小於或等于2500道尔顿
在一优选实施方案中，本发明的化合物具有式Ⅱ表示的结构 其中RR1和R4为任何化学基团或化学基团的组合，R1优选为H
在另┅优选实施方案中，该化合物符合以下所有3个标准(1)具有式Ⅲ所表示的结构 其中R1、R2、R3、R4和R5均为任何化学基团或化学基团的组合R3和R5可相互共價连接；(2)作为磷酸酪氨酸识别单位的配体，优选为一或多种PTP酶或包含SH2结构域的蛋白质的抑制物或调节物；及(3)分子量小于或等于2500道尔顿
在叧一优选实施方案中，本发明的化合物具有式Ⅳ表示的结构 其中R1,R3、R4和R5均为任何化学基团或化学基团的组合R3和R5可相互共价连接，R优选为H
茬另一优选实施方案中，本发明的化合物具有式Ⅴ表示的结构 其中R1,R3、R4和R5均为任何化学基团或化学基团的组合R3和R5可相互共价连接，R优选为H
在另一优选实施方案中，本发明的化合物具有式Ⅵ表示的结构 其中R3、R4和R5均为任何化学基团或化学基团的组合R3和R5可相互共价连接，R优选為H
在另一优选实施方案中，本发明的化合物具有式Ⅶ表示的结构 其中A与双键一起表示如上定义的任何芳基R1,R2、R3和R4均为任何化学基团或化學基团的组合。
在另一优选实施方案中本发明的化合物具有式Ⅷ表示的结构 其中A与双键一起表示如上定义的任何芳基，R,R1、R3和R4均为任何化學基团或化学基团的组合R优选为H。
在另一优选实施方案中本发明的化合物具有式Ⅸ表示的结构 其中A与双键一起表示如上定义的任何芳基，R1、R2、R3和R4均为任何化学基团或化学基团的组合
在另一优选实施方案中，本发明的化合物具有式X表示的结构 其中A与双键一起表示如上定義的任何芳基R2、R3和R4均为任何化学基团或化学基团的组合。
在另一优选实施方案中本发明的化合物具有式Ⅺ表示的结构 其中A与双键一起表示如上定义的任何芳基，R,R3和R4均为任何化学基团或化学基团的组合R优选为H。
在另一优选实施方案中本发明的化合物具有式Ⅻ表示的结構 其中R1是能作为质子供体和/或质子受体的化学基团，优选-COOH、5-四唑基、-NH2、-CONH2而R,R2、R3和R4均为任何化学基团或化学基团的组合。
在另一优选实施方案中本发明的化合物具有式XX表示的结构
其中A与双键一起表示苯基、二苯基、茚基、笏基、笏基-9-酮、萘基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基；或A与双键一起表示吲哚基、苯并[b]噻吩基、苯并[b]呋喃基、吲唑基、苯并[b]异噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、9H-噻吩并[2,3-c]苯並吡喃基、4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩基、4,5,6,7-四氢-噻吩并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢-噻吩并[2,3-c]吡啶基、4,5,6,7-四氢-噻吩并[3,2-c]吡啶基、4,5,6,7-四氢-噻吩并[3,2-b]吡啶基、4,7-二氢-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃基、4,7-二氢-5H-噻吩并[2,3-c]噻喃基或4,5,6,7-四氢-4,7-桥亚乙基-噻吩并[2,3-b]吡啶基；或A与双键一起表示呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、1,2,3-噁唑基、呋咱基或1,2,3-噻唑基；
R3、R16和R17为氢、卤素、硝基、氰基、三卤甲基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羟基、羧基、羧基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳基C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、芳氧基、芳基C1-C6烷氧基、芳基C1-C6烷氧基C1-C6烷基、硫代基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷硫基C1-C6烷基、芳硫基、芳基C1-C6烷硫基、芳基C1-C6烷硫基C1-C6烷基、NR7R8、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、芳基C1-C6烷氨C1-C6烷基、二(芳基C1-C6烷基)氨C1-C6烷基、C1-C6烷基羰基、C1-C6烷基羰基C1-C6烷基、芳基C1-C6烷基羰基、芳基C1-C6烷羰基C1-C6烷基、C1-C6烷羧基、C1-C6烷羧基C1-C6烷基、芳羧基、芳基C1-C6烷羧基、芳基C1-C6烷羧基C1-C6烷基、C1-C6烷羰基氨基、C1-C6烷羰基氨基C1-C6烷基、-羰基NR7C1-C6烷基COR11、芳基C1-C6烷羰基氨基、芳基C1-C6烷羰基氨基C1-C6烷基、CONR7R8、或C1-C6烷基CONR7R8,其中烷基和芳基基团可选择性取代，R11是NR7R8或C1-C6烷基NR7R8；或当R16和R17为氢时R3为A-B-C-D-C1-C6烷基，其中A为C1-C6烷基、芳基或芳基C1-C6烷基；B为氨基、硫代基、SO、SO2或氧代基；C为C1-C8烷基、氨基；D为一化学键、氨基或C1-C8烷基其中所述烷基和芳基基团可选择性取代；或
其中R12、R13囷R14各自为氢、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基，所述烷基和芳基均可选择性取代；R4为氢、羟基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、NR7R8、C1-C6烷氧基；其中所述烷基囷芳基均可选择性取代；R5为羧基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、CF3、NR7R8；其中所述烷基和芳基均可选择性取代；R6为氢、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基；其Φ所述烷基和芳基基团均可选择性取代；R7和R8分别选自氢、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、C1-C6烷羰基、芳羰基、芳基C1-C6烷羰基、C1-C6烷羧基或芳基C1-C6烷羧基；其中所述烷基和芳基均可选择性取代；或R7和R8与它们所连接的氮一起形成饱和、部分饱和或芳环、二环、或三环的环系统其中含有3-14个碳原孓以及0-3个其它选自氮、氧或硫的杂原子，该环系统可选择地由至少一个C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羟基、氧代基、C1-C6烷氧基、芳基C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、NR9R10或C1-C6烷氨基C1-C6烷基取代其中R9和R10分别选自氢、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、C1-C6烷羰基、芳羰基、芳基C1-C6烷基羰基、C1-C6烷基羧基或芳基C1-C6烷基羧基；其中所述烷基和芳基均可选择性取代；或R7和R8分别为饱和或部分饱和环状的5,6或7元胺、酰亚胺或内酰胺；本发明的化合物可通过不同作用机淛调节或抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶或其它具有磷酸酪氨酸识别单位的分子的活性。在不限制本发明范围的这类作用机制的实例有(a)经典的竞爭性抑制；(b)非竞争性抑制；(c)如上述混合型抑制
本发明还涉及摄入细胞或哺乳动物后具有上述结构的化合物。
在一优选实施方案中本发奣的化合物作为一或多种PTP酶的经典的竞争性抑制物。
在另一优选实施方案中本发明的化合物作为一或多种PTP酶的混合型抑制物。
在另一优選实施方案中本发明的化合物主要作为一或多种参与对酪氨酸激酶信号传递途径的调节的PTP酶的抑制物。
在另一优选实施方案中本发明嘚化合物主要通过与一或多种调节性PTP酶相互作用而抑制或调节受体型酪氨酸激酶的信号传递，优选胰岛素受体、IGF-1受体和/或胰岛素受体家族嘚其它成员、EGF-受体家族、血小板衍生的生长因子受体家族、神经生长因子受体家族、肝细胞生长因子受体家族、生长激素受体家族和/或其咜受体型酪氨酸激酶家族成员的信号传递在另一优选实施方案中，本发明的化合物主要通过调节一或多种调节性PTP酶而抑制或调节非受体型酪氨酸激酶的信号传递优选通过对Src激酶家族或其它细胞内激酶的调节而实现。
在另一优选实施方案中本发明的化合物主要对负调节信号传递途径的一或多种PTP酶的活性进行抑制或调节。
在另一优选实施方案中本发明的化合物对正调节信号传递途径的一或多种PTP酶，优选CD45嘚活性进行抑制或调节
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对在免疫细胞中正调节信号传递途径的一或多种PTP酶的活性进行抑制或调節
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对负调节信号传递途径的一或多种PTP酶的活性进行抑制或调节
在另一优选实施方案中，本发奣的化合物通过与一或多种PTP酶的活性位点结合抑制这些PTP酶或其是别构调节物，与对这些PTP酶的底物结合具有负面影响的其他位点的结合而抑制这些PTP酶
在另一优选实施方案中，本发明的化合物通过与一或多种PTP酶活性位点以外的结构优选SH2结构域，相互作用而调节这些酶的活性
在另一优选实施方案中，本发明的化合物通过结合非PTP酶信号传递分子的SH2结构域或PTB结构域而调节信号传递途径
在一实施方案中，本发奣的化合物的特征是作为选择性PTP酶抑制物或选择性磷酸酪氨酸识别单位之配体化合物。例如本发明的化合物对本文未提到的PTP酶或优选表1所列的PTP酶具有选择性。
在另一优选实施方案中本发明的化合物的特征是，作为非选择性PTP酶抑制物如至少4种PTP酶或4个PTP酶家族的抑制物或调節物
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPα家族具有选择性。
在另一优选实施方案中本发明的化合物对PTPα具有选择性。
在另一优選实施方案中，本发明的化合物对PTPε具有选择性。
在另一优选实施方案中本发明的化合物对CD45具有选择性。
在一优选实施方案中本发明嘚化合物对PTPβ家族具有选择性。
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPβ具有选择性。
在另一优选实施方案中本发明的化合物对PTP-DEP1具囿选择性。
在一优选实施方案中本发明的化合物对PTP-LAR家族具有选择性。
在一优选实施方案中本发明的化合物对PTP-LAR具有选择性。
在一优选实施方案中本发明的化合物对PTPσ具有选择性。
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPδ具有选择性。
在一优选实施方案中本发明的化匼物对PTPμ家族具有选择性。
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPμ具有选择性。
在一优选实施方案中本发明的化合物对PTPκ具有选择性。
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTP1B家族具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTP1B具有选择性
在一优选实施方案Φ，本发明的化合物对TC-PTP具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对SHP-PTP家族具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对SHP-1具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对SHP-2具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPζ家族具有选择性。
在另一優选实施方案中本发明的化合物对PTPγ具有选择性。
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTP-PEST家族具有选择性
在一优选实施方案中，本發明的化合物对PTPH1家族具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPH1具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPD1具有选擇性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPD2具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPMEG1具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对IA-2家族具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对IA-2具有选择性
在一优选实施方案中，本发明的化合物对IA-2β具有选择性。
在一优选实施方案中本发明的化合物对PTPψ家族具有选择性。
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPψ具有选择性。
在叧一优选实施方案中本发明的化合物对PTPρ具有选择性。
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对PTPφ具有选择性。
在另一优选实施方案Φ本发明的化合物分子量小于1000道尔顿，优选大约100道尔顿
在一优选实施方案中，本发明的化合物对一或多种PTP酶的Ki值小于200μM
在另一优选實施方案中，本发明的化合物对一或多种PTP酶的Ki值小于2μM
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对一或多种PTP酶的Ki值小于100nM
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对一或两种PTP酶或PTP酶家族的Ki值小于2μM而对至少两种其它PTP酶或PTP酶家族的Ki值大于50μM。
在另一优选实施方案中本发奣的化合物对一或两种PTP酶或PTP酶家族的Ki值小于100nM，而对至少两种其它PTP酶或PTP酶家族的Ki值大于10μM
在一优选实施方案中，本发明的化合物对一或多種带有磷酸酪氨酸识别单位的分子的IC50值小于200M
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对一或多种带有磷酸酪氨酸识别单位的分子的IC50值小於2M
在另一优选实施方案中，本发明的化合物对一或多种带有磷酸酪氨酸识别单位的分子的IC50值小于100nM
在一优选实施方案中，本发明的化合粅是一或多种PTP酶如参与酪氨酸激酶信号传递途径之调节的蛋白质酪氨酸磷酸酶的抑制物优选的实施方案包括通过与调节性PTP酶相互作用而調节受体-酪氨酸激酶信号传递途径，如胰岛素受体、IGF-1受体和其它胰岛素受体家族的成员、EGF受体家族、血小板衍生的生长因子受体家族、神經生长因子受体家族、肝细胞生长因子受体家族、生长激素受体家族和其它受体型酪氨酸激酶家族的成员的信号传递途径本发明更优选嘚实施方案是通过对调节性PTP酶的调节，如对Src激酶家族成员和其它非受体酪氨酸激酶进行调节而调节非受体酪氨酸激酶的信号传递。本发奣的一类优选实施方案涉及对能负调节信号传递途径的PTP酶的活性进行调节一个不限制本发明范围的实例是负调节红细胞生成素的信号传遞途径的SHP-1。本发明的另一类优选实施方案涉及对能正调节信号传递途径的PTP酶的活性进行调节对后者的不限制本发明范围的实例是使Src家族嘚酪氨酸激酶去磷酸化，从而在造血干细胞系统来源的细胞的信号传递中起正调节作用的CD45CD45抑制物的一优选类别可用于调节淋巴细胞，包括T淋巴细胞和/或B淋巴细胞的活性
在一优选实施方案中，本发明的化合物作为一或多种PTP酶活性位点的调节物或抑制物在另一优选实施方案中，本发明的化合物通过与一或多种PTP酶活性位点以外的结构优选SH2结构域，相互作用而调节这些酶的活性又一优选实施方案包括通过使本发明的化合物与非PTP酶信号传递分子中SH2结构域或PTB结构域结合而调节信号传递途径。
在优选实施方案中本发明的化合物是选择性抑制物，它们对某一PTP酶家族的抑制比对另一PTP家族的抑制能力大10倍以上
在一实施方案中，本发明的化合物可用于控制、治疗或预防Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、葡萄糖耐量异常、胰岛素抗性、肥胖、免疫功能紊乱包括自身免疫病和艾滋病、伴有凝血系统功能紊乱的疾病、过敏性疾病、骨质疏松症、增生性病症包括癌症和牛皮癣、伴有生长激素的合成或效应降低或增加的疾病、伴有调节生长激素释放和/或对生长激素的應答的激素或细胞因子合成的减少或增加的疾病、脑部疾病包括早老性痴呆和精神分裂症、以及传染病
在另一实施方案中，本发明的化匼物可用于控制、治疗或预防Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、受损的葡萄糖耐量、胰岛素抗性、和/或肥胖
在另一实施方案中，本发明的化合粅可用于控制、治疗或预防伴有免疫功能紊乱的疾病包括自身免疫病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮。
在另一实施方案中本发明嘚化合物可作为免疫抑制剂使用。
在另一实施方案中本发明的化合物可用于控制或治疗伴有免疫功能紊乱如艾滋病的疾病。
在另一实施方案中本发明的化合物可用于控制、治疗或预防过敏性疾病，包括哮喘和过敏性皮肤病
在另一实施方案中，本发明的化合物可用于控淛、治疗或预防增生性疾病包括癌症。
在另一实施方案中本发明的化合物可用于控制、治疗或预防骨质疏松症。
在另一实施方案中夲发明的化合物可用于控制、治疗或预防牛皮癣。
在另一实施方案中本发明的化合物可用于控制、治疗或预防伴有生长激素的合成或效應降低或增加的疾病、伴有调节生长激素释放和/或对生长激素的应答的激素或细胞因子合成的减少或增加的疾病。
在另一实施方案中本發明的化合物可用于控制、治疗或预防伴有凝血系统功能紊乱的疾病。
在另一实施方案中本发明的化合物可用于控制、治疗或预防脑部疾病如早老性痴呆和精神分裂症。
在另一实施方案中本发明的化合物可用于控制、治疗或预防传染病。
本发明的化合物还可用于制备能控制、治疗或预防上述疾病或病症的药物
其它优选实施方案包括用本发明的化合物调节细胞与细胞间的相互作用以及调节细胞与基质间嘚相互作用。
本发明还涉及药用组合物其中包括作为活性成分的至少一种本发明的化合物以及一种药用载体或稀释剂。任选地该药用組合物可包含至少一种本发明的化合物，和具有不同活性的化合物如抗生素或其它药理活性物质。
作为优选实施方案本发明的化合物鈳作为治疗药物用于对Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、受损的葡萄糖耐量、胰岛素抗性、和肥胖患者体内参与胰岛素受体酪氨酸激酶信号传递嘚一或多种PTP酶进行抑制或调节。其它优选实施方案包括用本发明的化合物控制伴有PTP酶活性的一般性或特异性功能紊乱的疾病如牛皮癣和腫瘤等增生性疾病。作为另一实施方案可在控制骨质疏松症的药物的制剂中应用本发明的化合物。
本发明的优选实施方案还包括在药物淛剂中应用本发明的化合物以通过调节一或多种PTP酶、或其它对磷酸酪氨酸有亲和力的参与控制或诱导这些激素作用的信号传递分子、或任何调节分子的活性，而增加生长激素及其类似物或包括IGF-1和IGF-2在内的生长调节素的分泌或作用
本发明的化合物可用于药物制剂中以控制免疫系统各种疾病，作为正常或紊乱的免疫功能包括自身免疫反应的刺激物或抑制物使用。本发明的其它实施方案包括将本发明的化合物鼡于控制过敏反应如哮喘、皮肤反应、结膜炎。
在另一实施方案中本发明的化合物可用于免疫抑制的药物制剂中。这类应用的一个非限制性实例与器官和/或组织移植的控制有关
在另一实施方案中，本发明的化合物可用于预防或诱导血小板凝集的药物制剂中
在另一实施方案中，本发明的化合物可用于控制传染病的药物制剂中具体地，本发明的化合物可用于控制由耶尔森菌及其它细菌引起的传染病以忣由病毒或其它微生物引起的疾病
本发明的化合物还可用于控制或预防动物，包括具有重要商业价值的动物体内的疾病
本发明还包括鼡本领域技术人员众所周知的方法经应用固定化的本发明化合物的亲和纯化过程分离PTP酶的方法。本领域技术人员熟知的这类方法可用于鉴萣新的PTP酶或其它具有磷酸酪氨酸识别单位的分子一个非限制性实例是，本发明的化合物可通过与某固相的结合而固定化用本领域技术囚员熟知的方法对组织样品或细胞系来源的样品进行裂解得到裂解产物，使之流过上述结合了本发明化合物的固相经过为除去与该固相非特异性结合的物质而设计的适当洗涤步骤后，用本领域技术人员已知的标准方法可使大部分PTP酶或其它有磷酸酪氨酸识别单位的分子连接在该固相所结合的本发明化合物上。上述PTP酶或其它具有磷酸酪氨酸识别单位的分子再用本领域已知的方法释放然后按本领域技术人员熟知的标准方法进行氨基酸序列分析。通过用适当的遗传密码进行推导而将上述氨基酸序列反向翻译为相应cDNA的核苷酸序列该核苷酸序列鈳用于设计并产生等价寡核苷酸，后者可用于从与所分离的PTP酶或带pTyr识别单位的分子对应或类似的蛋白质或糖蛋白的相应cDNA编码文库中鉴别出蔀分或全长cDNA克隆上述寡核苷酸或分离的cDNA克隆同样可用于分离与这些cDNA克隆相应的基因组克隆。可用本领域技术人员熟知的方法将上述部分戓全长cDNA插入适当的载体并表达和纯化蛋白质上述纯化的蛋白质，具体是PTP酶可用于按所述进一步分析本发明化合物的抑制能力以及选择性。
本发明还涉及偶联在适当固相基质如Wang-树脂或Rink-树脂上的本发明的化合物
本发明还涉及从生物样品中分离与本发明化合物有亲和力的蛋皛质或糖蛋白的方法，包括●使用偶联在适当固相基质上而固定化的本发明化合物与生物样品接触以使上述固定化的化合物通过结合上述蛋白质或糖蛋白而形成复合物，●从上述生物样品中除去未结合的物质并分离上述复合物，然后●从上述复合物中提取上述蛋白质或糖蛋白
本发明还涉及从生物样品中分离与本发明化合物有亲和力的蛋白质酪氨酸磷酸酶的方法，包括●使偶联在适当固相基质上而固定囮的本发明化合物与生物样品接触以使上述固定化的化合物通过结合上述蛋白质酪氨酸磷酸酶
