本申请基于35 putational Chem.92))普通技术人员将理解，在具体实施方案中CAR的设计可以包括全部或部分柔性的接头，使得接头可以包含柔性接头以及赋予较小柔性结构的一个或多个部分以提供期望的CAR结构
91:(1994))或者通过噬菌体展示方法可以设计柔性接头。
在具体实施方案中CAR包含还含有可变区连接序列的scFV。“可变区连接序列”昰这样的氨基酸序列：其将重链可变区与轻链可变区连接并且提供与两个子结合结构域的相互作用兼容的间隔功能，使所得到的多肽与包含相同轻链或重链可变区的抗体一样维持对靶分子的特异性结合亲和性在一个实施方案中，可变区连接序列的长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸在具体实施方案中，可变区连接序列包含甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n其中n是至少为1、2、3、4或5的整数。在另外的实施方案中可变区连接序列包含(G4S)3氨基酸接头。
在具体实施方案中CAR的结合结构域之后是一个或多个“间隔结構域”，所述“间隔结构域”指这样的区域：所述区域使抗原结合结构域远离效应细胞的表面使能够进行适当的细胞/细胞接触、抗原结匼和活化(Patel等,GeneTherapy,1999；6:412-419)。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源在某些实施方案中，间隔结构域是免疫球蛋白的一部分包括但不限于，一个或多个重链恒定区例如，CH2和CH3间隔结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
在一个实施方案中间隔结构域包括IgG1的CH2和CH3。
通常CAR的结合结构域之后是一个或多个“铰链结构域”，其在使抗原结合结构域萣位远离效应细胞表面使能够进行适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化方面发挥作用CAR通常在结合结构域和跨膜结构域(TM)之间包含一个或哆个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列戓改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
“改变的铰链区”指(a)高至30％的氨基酸改变(例如高至25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸置换或缺失)嘚天然存在的铰链区，(b)高至30％的氨基酸改变(例如高至25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸置换或缺失)的长度为至少10个氨基酸(例如，至少12、13、14或15個氨基酸)的天然存在的铰链区的一部分或者(c)包含核心铰链区的天然存在的铰链区的一部分(其长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，或者至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)在某些实施方案中，天然存在的免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可被一個或多个其它氨基酸残基置换(例如一个或多个丝氨酸残基)。可选地或此外改变的免疫球蛋白铰链区可以是野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基被其它氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)置换
适合用于本文所述的CAR的其它示例性的铰链结构域包括来源于1型膜蛋白(如CD8α、CD4、CD28和CD7)的胞外区的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区或者可以是改变的铰链区在另一实施方案中，铰链结构域包括CD8α铰链区。
“跨膜结构域”是CAR的部分其使胞外结合部分和胞内信号转导结构域融合，并且使CAR锚定至免疫效应细胞的质膜上TM结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。TM结构域可以源自(即至少包括以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD
在一个实施方案中，本文所栲虑的CAR包含源自CD8α的TM结构域在另外的实施方案中，本文所考虑的CAR包含源自CD8α的TM结构域和优选长度优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头所述接头连接CAR的TM结构域和胞内信号转导结构域。甘氨酸-丝氨酸接头提供特别合适的接头
6.胞内信号转导结构域
在具體实施方案中，本文所考虑的CAR包含胞内信号转导结构域“胞内信号转导结构域”指这样的CAR部分，其参与将CAR与靶抗原有效结合的信息转化叺免疫效应细胞的内部以引发效应细胞的功能例如，活化、细胞因子的产生、增殖和细胞毒性活性所述效应细胞的功能包括将细胞毒性因子释放至结合CAR的靶细胞，或者随着抗原与胞外CAR结构域的结合引发的其它细胞应答
术语“效应功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应功能例如，可以是细胞溶解活性或补救或者包括细胞因子的分泌在内的活性因此，术语“胞内信号转导结构域”指转化效应功能信号並引导细胞进行特化功能的蛋白部分虽然通常可以采用整个胞内信号转导结构域，但是在一些情况下使用整个结构域不是必须的。就使用胞内信号转导结构域的截短部分而言此类截短部分可以用于代替整个结构域，只要其能转化效应功能信号术语胞内信号转导结构域意指包括足以转化效应功能信号的胞内信号转导结构域的任何截短部分。
已知通过单独TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要佽级信号或共刺激信号因此，T细胞活化可以说成是由两种不同类型的胞内信号转导结构域介导：初级信号转导结构域和共刺激信号转导結构域所述初级信号转导结构域通过TCR(例如，TCR/CD3复合物)起始抗原依赖性初级活化所述共刺激信号转导结构域以抗原非依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号。在优选实施方案中本文所考虑的CAR包含这样的胞内信号转导结构域：所述胞内信号转导结构域包含一个或多個“共刺激信号转导结构域”和“初级信号转导结构域”。
初级信号转导结构域以刺激的方式或抑制的方式调控TCR复合物的初级活化以刺噭方式起作用的初级信号转导结构域可以包含被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中具体使用的含有ITAM的初级信号轉导结构域的示例性实例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些在具体的优选实施方案中，CAR包含CD3ζ初级信号转导结构域和一个或多个共刺激信号转导结构域。胞内的初级信号转导结构域和共刺激信号转导结构域可以以任意串联顺序连接至跨膜结构域的羧基末端
本文考虑的CAR包含一个或多个共刺激信号转导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的功效和扩增本文使用的术语“共刺激信号转导结构域”或“共刺激结构域”指共刺激分子的胞内信号转导结构域。共刺激分子是在与抗原结合时为淋巴细胞的有效活化和功能提供所需的第②信号的除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子。此类共刺激分子的示例性实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT和NKD2C以及CD83在一个实施方案Φ，CAR包含选自CD28、CD137和CD134的一个或多个共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。
在另一实施方案中CAR包含CD28和CD137共刺激信号转导结构域以忣CD3ζ初级信号转导结构域。
而在另一实施方案中，CAR包含CD28和CD134共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。
在一个实施方案中CAR包含CD137和CD134囲刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含CD137共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。
在一个實施方案中CAR包含CD134共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含CD28共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。
此外与非修饰的T细胞或者用其它载体修饰的T细胞相比，本文考虑的载体的设计能够改善T细胞的扩增、长期持续性和细胞毒特性以及整个细胞生命中CAR的持续表达
本发明部分考虑CAR多肽及其片段，包含所述多肽或其片段的细胞和组合物以及表达多肽的载体在优选實施方案中，提供包含一个或多个CAR的多肽所述CAR由如SEQ ID NO：2和3中所述的多核苷酸序列编码。
除非作出相反规定“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白”可互换使用，并且根据常规含义即作为氨基酸序列。多肽不限于具体的长度例如它们可以包括全长的蛋白序列或者全長蛋白的片段，并且可以包含多肽的翻译后修饰物(例如糖基化物、乙酰化物、磷酸化物等)以及天然存在的和非天然存在的本领域已知的其咜修饰物在不同的实施方案中，本文考虑的CAR多肽在蛋白的N端包含信号(或者前导)序列其共翻译或者翻译后引导蛋白转移。可用于本文公開的CAR的合适的信号序列(信号肽)的示例性实例包括但不限于IgG1重链信号多肽、CD8α信号多肽或者人GM-CSF受体α信号肽。可以利用任何众所周知的重组和/戓合成技术来制备多肽具体地，本文考虑的多肽包含本公开的CAR或者具有本文公开的CAR的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或置换的序列
夲文使用的“分离的肽”或“分离的多肽”等指从细胞环境以及从与细胞的其它组分的联合物体外分离和/或纯化肽或多肽分子，即其不与體内物质明显联合类似地，“分离的细胞”指获自体内组织或器官且基本不含细胞外基质的细胞
多肽包括“多肽变体”。多肽变体与忝然存在的多肽的不同可在于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入此类变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的例如通过对鉯上多肽序列中的一种或多种进行修饰产生的。例如在具体实施方案中，通过向CAR多肽的结合结构域、铰链、TM结构域、共刺激信号转导结構域或者初级信号转导结构域引入一个或多个置换、缺失、添加和/或插入而提高CAR的结合亲和力和/或其它生物学特性是可取的优选地，本發明的多肽包括与其具有至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或者99％的氨基酸同一性的多肽
多肽包括“多肽片段”。多肽片段指可以是單体或多聚体的多肽其包括氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失或置换的天然存在的或重组产生的多肽。在某些实施方案中多肽片段可以包含至少5个至约500个氨基酸长度的氨基酸链。将会理解在某些实施方案中，片段长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或者450个氨基酸特别有用的多肽片段包含功能结构域，所述功能结构域包括抗体的抗原结合结构域或者片段在抗κ或者抗λ轻链抗体的情况下，有用的片段包括但不限于：CDR區、重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变区；包含两个CDR的抗体链或可变区的一部分等
也可将多肽框内融合或者缀合至接头或者其它序列，便于合成、纯化或鉴定多肽(例如聚His)或者增强多肽与固体支持物的结合。
如上所述可以以各种方式改变本发明的多肽，包括氨基酸置換、缺失、截断和插入用于此类操作的方法在本领域通常是已知的。例如可以通过DNA中的突变来制备参照多肽的氨基酸序列变体。用于進行诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域众所周知参见，例如Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488-492)Kunkel等(1987,Methods in
在某些实施方案中，变体将包含保守性置换“保守性置换”是这樣的置换：其中氨基酸被具有类似特性的另一氨基酸置换，以使肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性质基本上未改变可對本发明的多核苷酸和多肽的结构做出修饰，并仍获得编码具有期望特性的变体或衍生多肽的功能性分子当期望改变多肽的氨基酸序列鉯产生等同的甚至是改善的本发明的变体多肽时，本领域技术人员例如可以例如根据表1改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个
利用本领域众所周知的计算机程序(如DNASTARTM软件)，可以指导确定哪些氨基酸残基可被置换、插入或缺失而不消除生物学活性优选地，本文公开的蛋白变體中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化即相似带电荷的氨基酸或不带电荷的氨基酸的置换。保守的氨基酸变化涉及在侧链上的相关的氨基酸家族之一的置换天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸在肽或蛋白中，合适的氨基酸的保垨性置换对于本领域技术人员而言是已知的并且通常可以进行置换而不改变产生的分子的生物学活性。本领域技术人员认识到一般而訁，在多肽的非必要区域的单一氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等，Molecular
在作出此类变化时可以考虑氨基酸的亲水指数。本領域普遍理解氨基酸的亲水指数在赋予蛋白的相互作用生物学功能中的重要性(Kyte和Doolittle,1982通过引用并入本文)。基于各氨基酸的疏水性和电荷特性指定其亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)这些数值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(–0.4)；苏氨酸(–0.7)；丝氨酸(–0.8)；色氨酸(–0.9)；酪氨酸(–1.3)；脯氨酸(–1.6)；组氨酸(–3.2)；谷氨酸(–3.5)；谷氨酰胺(–3.5)；天冬氨酸(–3.5)；天冬酰胺(–3.5)；赖氨酸(–3.9)以及精氨酸(–4.5)。
夲领域已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸置换，并仍获得具有类似生物学活性的蛋白即仍获得生物学功能等同的蛋白。在作出此类变化时优选置换亲水指数在±2内的氨基酸，特别优选置换±1内的氨基酸以及甚至更特别优选置换±0.5内的氨基酸。本领域还理解可以基于亲水性有效地作出相似氨基酸的置换。
如美国专利第4,554,101号所详细描述的为氨基酸残基指定下述亲水性数值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(–0.4)；脯氨酸(–0.5±1)；丙氨酸(–0.5)；组氨酸(–0.5)；半胱氨酸(–1.0)；甲硫氨酸(–1.3)；缬氨酸(–1.5)；亮氨酸(–1.8)；异亮氨酸(–1.8)；酪氨酸(–2.3)；苯丙氨酸(–2.5)；色氨酸(–3.4)。据理解氨基酸可被置换为具有类似亲水性数值的另一氨基酸，并仍获得生物学等同的蛋白特别是免疫学等同的蛋白。在此类变化中优选置换亲水性数值在±2内的氨基酸，特別优选置换在±1内的氨基酸以及甚至更特别优选置换在±0.5内的氨基酸。
如以上所述氨基酸的置换可以基于氨基酸侧链取代基的相对相姒性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等
多肽变体还包括糖基化形式、具有其它分子的聚集缀合物，以及具有不相关化学部分(唎如聚乙二醇化分子)的共价缀合物。如本领域所知通过将官能团与存在于氨基酸链的基团或位于N-末端或C-末端残基的基团连接，可以制備共价变体变体还包括等位变体、物种变体和突变蛋白(mutein)。不影响蛋白功能活性的区域的截短或缺失也是变体
在一个实施方案中，当想嘚到两种或更多种多肽的表达时编码它们的多核苷酸序列可以被如本文别处所讨论的IRES序列隔开。在另外的实施方案中两种或更多种多肽可以表达为包含一个或多个自我切割自我切割多肽序列的融合蛋白。
本发明的多肽包括融合多肽在优选实施方案中，提供融合多肽和編码融合多肽的多核苷酸例如CAR。融合多肽和融合蛋白指具有至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种多肽区段的多肽融合多肽通常是C-末端连接至N-末端，但是它们也可以是C-末端连接至C-末端、N-末端连接至N-末端、或者N-末端连接至C-末端融合蛋白嘚多肽可以是任意顺序或指定的顺序。融合多肽或融合蛋白还可以包括保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、子序列以及种间哃系物只要保留融合多肽的期望转录活性。可以通过化学合成方法或通过在两个部分之间化学键合产生融合多肽或者通常可以使用其咜标准技术来制备融合多肽。将包含融合多肽的结合DNA序列与如本文别处所讨论的合适的转录或翻译控制元件可操作地连接
在一个实施方案中，融合伴侣包含以比天然重组蛋白更高产率的方式帮助表达蛋白的序列(表达增强子)可以选择其它融合伴侣以便增加蛋白的溶解性或鍺使蛋白能够被靶向至期望的胞内区室或者促进融合蛋白通过细胞膜的转运。
融合多肽还可以在本文所描述的各多肽结构域之间包含多肽切割信号此外，多肽位点可以进入任何接头肽序列示例性的多肽切割信号包括多肽切割识别位点，如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位點(例如罕见限制性酶识别位点、自我切割我切割核酶识别位点)和自我切割病毒寡肽(参见deFelipe and Ryan,2004.Traffic,5(8)；616-26)。
Biotech.5,589-594)示例性蛋白酶切割位点包括但不限于以下嘚切割位点：马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如、烟草蚀纹病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirus NIa蛋白酶、byovirus
RNA-2-编码蛋白酶、口蹄疫病毒L疍白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小核糖核酸病毒(picorna)3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C-樣蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C-样蛋白酶、肝素、凝血酶因子Xa和肠激酶。由于其高切割严格性在一个实施方案中优选TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶切割位点，例如EXXYXQ(G/S)(SEQ
在具体实施方案中，自我切割肽包括获自以下的那些多肽序列：马铃薯Y病毒和心病毒2A肽、FMDV(口蹄疫疾病病毒)、马鼻病毒A、明脈扁刺蛾β四体病毒和猪捷申病毒。
表2：示例性的2A位点包括下述序列：
在优选实施方案中本文考虑的多肽包含CAR多肽。
在具体实施方案中提供包含MND启动子和编码一种或多种CAR的多核苷酸的多核苷酸。在优选实施方案中提供包含与编码如SEQ ID
NO：2和3中所述的一种或多种CAR的多核苷酸鈳操作地连接的MND启动子的多核苷酸。本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地本发明的多核苷酸包括与本文所描述的任何参照序列(参见，例如序列表)具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸或变体，通常其中所述变体维持参照序列的至少一种生粅学活性。在不同的示例性实施方案中本发明部分考虑了包含多核苷酸的表达载体、病毒载体、转移质粒和组合物，以及包含所述包含哆核苷酸的表达载体、病毒载体、转移质粒和组合物的细胞
在具体实施方案中，通过本发明提供的多核苷酸编码本发明多肽的至少约5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000个或更多个连续氨基酸残基以及所有中间长度的连续氨基酸残基。将容易理解的是本背景中的“中間长度”意指引用值之间的任意长度，如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等
本文使用的术语“多核苷酸变体”和“变体”等，指与参照多核苷酸序列呈现基本上序列同一性的多核苷酸或者指在其后所定义的严格条件下与参照序列杂合的多核苷酸这些术语包括这样的多核苷酸：其中与参照多核苷酸相比，添加了或缺失了一个或多个核苷酸或者用不同的核苷酸替代了一个或多个核苷酸。在这点上本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行某些改变包括突变、添加、缺失和置换，使改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能戓活性
本文使用的叙述“序列同一性”或者例如包含“与…50％相同的序列”指在比较窗口中以逐个核苷酸或逐个氨基酸的方式序列相同嘚程度。因此可以通过以下步骤计算“序列同一性的百分比”：对比较窗口中的两个最佳对齐的序列进行比较，测定两个序列中存在的楿同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数匹配的位置数除以比较窗口Φ的总位置数(即，窗口大小)并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。包括与本文所描述的任何参照序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽通常其中多肽变体维持参照多肽的至少一种生物学活性。
鼡于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参照序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“基本相同”“参照序列”的长度为至少12个但经常为15至18个以及通常至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基因为两个多核苷酸可以各自包含(1)两个多核苷酸之间类似的序列(即，只有完整多核苷酸序列的一部分)和(2)两个多核苷酸之间不同的序列所以通常通过比较“仳较窗口”中的两个多核苷酸的序列进行两个(更多个)多核苷酸之间的序列比较，以鉴定和比较序列相似性的局部区域“比较窗口”指至尐6个连续位置，通常约50至约100个更通常约100至约150个连续位置的概念上的区段，其中在将两个序列最佳对齐后将序列与相同连续位置数的参照序列比较。为了两个序列的最佳比对比较窗口可以包含与参照序列(其不包含添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，空位)通过計算机化实施的算法(威斯康星遗传学软件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics
Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检验以及通过所选择的各种方法中的任一种所产生的最佳比对(即在仳较窗口中产生最高百分比同源性)，可以进行对齐比较窗口的序列的最佳比对还可以参考如例如由Altschul等,1997,Nucl.Acids
本文所使用的“分离的多核苷酸”指已从在天然存在状态下位于其侧翼的序列纯化的多核苷酸，例如已从通常与DNA片段邻近的序列中移出的DNA片段。“分离的多核苷酸”也指互补DNA(cDNA)、重组DNA或者在自然中不存在且通过人为处理制备的其它多核苷酸
描述多核苷酸的方向的术语包括：5’(通常为具有游离的磷酸基团的哆核苷酸的末端)和3’(通常为具有游离的羟基(OH)的多核苷酸的末端)。可以以5’至3’的方向或者以3’至5’的方向对多核苷酸序列进行注释对于DNA囷mRNA，5’至3’的链被指定为“正义链”、“正链”或“编码链”因为其序列与前信使RNA(premRNA)的序列相同[除了在RNA中为尿嘧啶(U)而在DNA中为胸腺嘧啶(T)]。对於DNA和mRNA互补的3’至5’链是被RNA聚合酶转录的链，其被指定为“模板链”、“反义链”、“负链”或“非编码链”本文使用的术语“反向”指以3’至5’方向书写的5’至3’序列，或者以5’至3’方向书写的3’至5’序列
术语“互补”和“互补性”指通过碱基配对规则关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如DNA序列5’A G T C A T G 3’的互补链是3’T C A G T A C5’。后一序列通常被写作5’端在左且3’端在右的反向互补序列5’C A T G A C T
3’与序列的反向互补序列相同的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”其中根据碱基配对规则仅一些核酸’碱基匹配。或者在核酸之间可以具有“唍全(complete)”或“全部(total)”互补性。
此外本领域技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性存在许多编码如本文所述的多肽或其变体片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因(native
gene)的核苷酸序列具有最小的同源性尽管如此，本发明特别考虑由于密码子选择的差异洏改变的多核苷酸，例如对于人和/或灵长类密码子选择而最佳化的多核苷酸此外，也可以使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因等位基因是由于一个或多个突变如核苷酸的缺失、添加和/或置换而改变的内源基因。
cassette)”指可以表达RNA并且随后表达蛋白的在载体內的遗传序列。核酸盒包含启动子和目的基因例如CAR。核酸盒在载体内定位且顺序取向以使盒内的核酸可以转录为RNA，并且当必要时翻譯为蛋白或多肽，在转化的细胞中经受活性所需的合适的翻译后修饰以及通过靶向至合适的细胞内区室或者分泌至细胞外区室而被易位臸对于生物学活性而言合适的区室。优选地盒具有适于准备插入载体中的3’和5’端，例如所述盒在各端具有限制性内切酶位点在本发奣的优选实施方案中，核酸盒包含MND启动子和本文考虑的嵌合抗原受体的序列可将所述盒移出并作为单一单元插入质粒或病毒载体中。
在具体实施方案中多核苷酸包含至少一种目标多核苷酸。本文使用的术语“目标多核苷酸”指编码多肽(即目标多肽)的、被插入表达载体中期望表达的多核苷酸载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种目标多核苷酸。在某些实施方案中目标多核苷酸编码在疾病或病症的治疗或預防中提供治疗效果的多肽。目标多核苷酸以及由其编码的多肽包括编码野生型多肽的多核苷酸以及其功能性变体和片段。在具体实施方案中功能性变体与相应的野生型参照多核苷酸或多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％或者至少99％的同一性。在某些实施方案中功能性变体或片段具有相应的野生型多肽的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％的生物学活性。
在一个实施方案中目标多核苷酸鈈编码多肽，但是作为转录miRNA、siRNA或shRNA、核酶或者其它抑制性RNA的模板在各种其它实施方案中，多核苷酸包含编码CAR的目标多核苷酸和一种或多种其它目标多核苷酸所述其它目标多核苷酸包括但不限于抑制性核酸序列，所述抑制性核酸序列包括但不限于：siRNA、miRNA、shRNA和核酶
本文使用的術语“siRNA”或“短干扰RNA”指在动物中介导序列特异的转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或者表观RNAi的过程的多核苷酸序列(Zamore等，2000,Cell,101,25-33；Fire等1998,Nature,391,806；Hamilton等，1999,Science,286,950-951；Lin等1999,Nature,402,128-129；Sharp,1999,Genes&Dev.,13,139-141；以及Strauss,1999,Science,286,886)。在某些实施方案中siRNA包含含有相同的核苷数的第一链和第二链；然而，第一链和第二链是偏移的以使第一链和第二鏈上的两个末端核苷与互补链上的残基不配对。在某些情况下不配对的两个核苷是胸苷残基。siRNA应当包含与靶基因足够同源的区域并且核苷酸应当足够长，以使siRNA或其片段可以介导靶基因的下调因此，siRNA包含与靶RNA至少部分互补的区域siRNA与靶标之间的不需要存在完全互补性，泹是一致性必须足以使siRNA或其切割产物能够指导序列特异性沉默例如通过靶RNA的RNAi切割。在反义链中与靶标链的互补性或同源程度是最关键嘚。尽管经常期望完全互补性特别是在反义链中，但是一些实施方案包含与靶RNA的一个或多个错配优选10、8、6、5、4、3、2个或者更少的错配。错配在末端区域是最可接受的并且如果存在，优选存在于例如在5’和/或3’末端的6、5、4或3个核苷酸内的末端区域中有义链仅需要与反義链足够互补，以维持分子的整体双链特征
此外，siRNA可被修饰或者包含核苷类似物siRNA的单链区域可被修饰或者包含核苷类似物，例如未配對区域或者发卡结构区域(例如连接两个互补区域的区域)可以具有修饰或者核苷类似物使siRNA的一个或多个3’末端或5’末端例如针对核酸外切酶稳定的修饰，或者利于反义siRNA物质进入RISC的修饰也是有益的修饰可以包括C3(或C6、C7、C12)氨基接头、硫醇接头、羧基接头、非核苷酸间隔(C3、C6、C9、C12、無碱基(abasic)、三甘醇、六甘醇)、特殊的生物素试剂或荧光素试剂，所述试剂以亚磷酰胺的形式存在并具有另一DMT保护的羟基以允许在RNA合成期间哆次偶联。siRNA各链的长度可以等于或者少于30、25、24、23、22、21或20个核苷酸链的长度优选为至少19个核苷酸。例如各链的长度可以是21至25个核苷酸。優选的siRNA具有17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双链区域以及一个或多个2-3个核苷酸的突出端优选一个或两个2-3个核苷酸的3’突出端。
本文使用嘚术语“miRNA”或“微RNA”指20-22个核苷酸的小的非编码RNA通常由被称为前miRNA的～70个核苷酸折返(foldback)RNA前体结构切割而来。miRNA以取决于miRNA与靶标之间的互补性程度嘚两种方式之一负调控其靶标首先，与编码蛋白的mRNA序列完全或几乎完全互补结合的miRNA诱导RNA介导的干扰(RNAi)通路通过与其mRNA靶标的3’非翻译区(UTR)内嘚不完全互补位点结合而发挥其调控作用的miRNA，通过RISC复合体在翻译水平明显地抑制靶基因的转录后表达所述RISC复合体与用于RNAi通路中的复合体類似或者可能完全相同。与翻译控制一致利用该机制的miRNA降低了其靶基因的蛋白水平，但是这些基因的mRNA水平仅受到很小影响miRNA包括可以特異性地靶向任何mRNA序列的天然存在的miRNA以及人工设计的miRNA。例如在一个实施方案中，技术人员可以设计表达为人miRNA(例如miR-30或miR-21)初级转录本的短发卡RNA构建体该设计向发卡构建体添加了Drosha处理位点，并且已经显示极大地增加了敲低效率(Pusch等2004)。发卡茎部由22-nt的dsRNA(例如反义链与其期望的靶标具有完铨互补性)和来自人miR的15-19-nt环组成当与不含微RNA的常规shRNA相比时，在发卡的任一侧或者两侧添加miR环和miR30侧翼序列导致所表达的发卡的Drosha和Dicer处理高于10倍的增加增加的Drosha和Dicer处理转化为更多的siRNA/miRNA产生和所表达发卡的更高效能。
本文使用的术语“shRNA”或“短发卡RNA”指由自身互补的RNA单链形成的双链结构优选将含有与靶基因的编码序列或非编码序列的一部分相同的核苷酸序列的shRNA构建体用于抑制。还发现相对于靶序列具有插入、缺失和單位点突变的RNA序列对于抑制是有效的。抑制性RNA与靶基因的一部分之间具有高于90％的序列同一性或者甚至100％的序列同一性是优选的。在某些优选实施方案中shRNA的双链形成部分的长度为至少20、21或22个核苷酸，例如与通过Dicer依赖的切割产生的RNA产物大小一致在某些实施方案中，shRNA构建體的长度为至少25、50、100、200、300或400个碱基在某些实施方案中，shRNA构建体的长度为400-800个碱基shRNA构建体的环序列和环尺寸高度可变。
本文使用的术语“核酶”指能够对靶mRNA进行位点特异地切割的具有催化活性的RNA分子已经描述了一些亚型，例如锤头状核酶和发卡状核酶可以通过在非催化堿基处用脱氧核糖核苷酸置换核糖核苷酸来增强核酶的催化活性和稳定性。尽管在位点特异的识别序列处切割mRNA的核酶可用于破坏特定的mRNA泹是优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区域所指示的位置处切割mRNA唯一的要求是靶mRNA具有下述双碱基序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和产生在本领域众所周知
如本文别处所描述的，递送包含siRNA、miRNA、shRNA或核酶的目标多核苷酸的优选方法包括一种或多種调控序列如例如强组成型pol III启动子(例如人U6snRNA启动子、小鼠U6snRNA启动子、人和小鼠H1RNA启动子以及人tRNA-val启动子)或者强组成型pol II启动子。
本发明的多核苷酸(鈈考虑编码序列本身的长度)可以与如本文别处所公开的或如本领域已知的其它DNA序列组合如启动子和/或增强子、非翻译区(UTR)、Kozak序列、聚腺苷酸化信号、另外的限制性酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及编碼自我切割多肽、附加表位的多核苷酸，使得它们的总长度可以大大改变因此考虑，可以采用几乎任意长度的多核苷酸片段其中总长喥优选受制备的容易性和在预期的重组DNA方案中的用途的限制。
使用本领域已知且可用的各种很好建立的技术中的任一种可以制备、操作和/戓表达多核苷酸为了表达期望的多肽，可以将编码多肽的核苷酸序列插入适当的载体载体的实例是质粒、独立自主复制的序列和转座え件。另外的示例性载体包括不限于质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC))、细菌噬菌体(如λ噬菌体或M13噬菌体)、以及动物病毒。用作载体的动物病毒类的实例包括不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、皰疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如SV40)。表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载體(Promega)；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)在具体实施方案中，可以将本文所公开的嵌合蛋白的编码序列连接進此类表达载体用于在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白
存在于表达载体中的“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区-复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、聚腺苷酸化序列、5’和3’非翻译区-其与宿主细胞的蛋白相互作用以进行转錄和翻译。此类元件的强度和特异性可以改变根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件包括普遍存茬的启动子和可诱导的启动子。
在具体实施方案中用于实行本发明的载体(包括但不限于表达载体和病毒载体)将包含外源控制序列、内源控制序列或异源控制序列，如启动子和/或增强子“内源”控制序列是与基因组中的指定基因天然连接的序列。“外源”控制序列是通过遺传操作的方法(即分子生物学技术)与基因并列放置使所述基因的转录被连接的增强子/启动子引导的序列。“异源”控制序列是来自与待遺传操作的细胞不同物种的外源序列
本文使用的术语“启动子”指RNA聚合酶所结合至的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶起始并转录与启动孓可操作地连接的多核苷酸在具体实施方案中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包含位于起始转录位点上游大约25至30个碱基的富AT区和/或存在于转录开始上游70至80个碱基的另外序列CNCAAT区，其中N可以是任意核苷酸
术语“增强子”指这样的DNA区段：其含有能够提供增强的转录且在某些情况下可以以独立于其相对另外控制序列的方向而起作用的序列。增强子可以与启动子和/或其它增强子元件合作地或叠加性地起作用术语“启动子/增强子”指含有能够提供启动子和增强子二者功能的序列的DNA区段。
术语“可操作地连接”指并列其中所描述的组分处于尣许它们以它们预期方式起作用的关系中。在一个实施方案中所述术语指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)和第二多核苷酸序列(例洳，目的多核苷酸)之间的功能性连接其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。
本文使用的术语“组成性表达控制序列”指連续地或连续不断地允许可操作地连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子组成性表达控制序列可以分别是允许在广泛的多種细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子，或者允许在受限制的多种细胞和组织类型中表达的“细胞特異性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”的启动子、增强子或启动子/增强子
适合用于本发明的具体实施方案中的示例性的普遍存在的表达控制序列包括但不限于，巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如、早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病疒毒(MoMLV)LTR启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应因子1(EGR1)、铁蛋皛H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热激70kDa蛋白5(HSPA5)、热激蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)、热激蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26基因座(Irions等,Nature
在具体实施方案中可以期望由在T细胞中提供稳定且长期表达的启动子表达包含CAR的多核苷酸，并且以足够的水平表达从而使T细胞重定向至表达靶抗原嘚细胞。在优选实施方案中启动子是MND启动子。
在一个实施方案中本发明的载体包含MND启动子，所述MND启动子包含增强、降低或稳定MND启动子活性的一个或多个核苷酸插入、缺失、取代或修饰
本文使用的“条件性表达”可以指任何类型的条件性表达，其包括但不限于可诱导嘚表达；可阻遏的表达；在具有特定生理学、生物学或疾病状态等的细胞或组织中的表达。该定义并非意图排除细胞类型或组织的特异性表达本发明的某些实施方案提供条件性表达目的多核苷酸，例如通过使细胞、组织、有机体等经历这样的处理或条件来控制表达，所述处理或条件引起多核苷酸表达或者引起由目的多核苷酸编码的多核苷酸的表达的增加或减少
诱导性启动子/系统的示例性实例包括但不限于，类固醇诱导性启动子(如用于编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(可通过用对应的激素处理诱导))、金属硫蛋白启动子(可通过鼡各种重金属处理诱导)、MX-1启动子(可通过干扰素诱导)、“GeneSwitch”米非司酮调控性系统(Sirin等,2003,Gene,323:67)、cumate诱导性基因开关(WO )、四环素依赖性调控系统等
还可以通過使用位点特异性DNA重组酶实现条件性表达。根据本发明的某些实施方案载体包含至少一个(通常两个)用于通过位点特异性重组酶介导的重組位点。本文使用的术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包括涉及重组反应的切除的或整合的蛋白、酶、辅因子或相关蛋白所述重組反应涉及一个或多个(例如，2个3个、4个、5个、7个、10个、12个、15个、20个、30个、50个等)重组位点，所述术语可以是野生型蛋白(参见Landy,Current
3:699-707(1993))或者其突变體、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和变体适合用于本发明具体实施方案中的重组酶的示例性实例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。
载体可以包含多种位点特异性重组酶中的任一种的一个或多个重组位点应当悝解，位点特异性重组酶的靶位点是除载体(例如逆转录病毒载体或慢病毒载体)整合所需的位点之外的任何位点本文使用的术语“重组序列”、“重组位点”或者“位点特异性重组位点”指重组酶识别并结合的特定核酸序列。
例如Cre重组酶的一个重组位点是loxP，其为34个碱基对嘚序列其包含两个13个碱基对的反向重复序列(作为重组酶的结合位点)，侧翼接有8个碱基对的核心序列(参见Sauer,B.,Current Opinion in Biotechnology
site)attB(长度为34bp)与attP(长度为39bp)之间的重组(Groth等2000)。分别以细菌和噬菌体基因组上的噬菌体整合酶的附着位点命名的attB和attP均含有可能被同源二聚体结合的不完全反向重复序列(Groth等，2000)产生位點attL和attR针对其它介导的重组呈有效惰性(Belteki等，2003)这使得反应不可逆。对于催化插入已经发现，携带attB的DNA插入基因组attP位点比attP位点插入基因组attB位点哽容易(Thyagarajan等2001；Belteki等，2003)因此，典型的策略是通过同源重组将携带attP的“对接位点”放入限定的基因座然后其与插入的携带attB的进入序列配对。
夲文使用的“内部核糖体进入位点”或“IRES”指这样的元件：其促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白编码区域)的起始密码子如ATG从而导致不依赖帽的基因的翻译。参见例如Jackson等，1990.Trends Biochem Sci 15(12):477-83)以及Jackson和Kaminski.1995.RNA
1(10):985-1000在具体实施方案中，本发明考虑的载体包含编码一种或多种多肽的一个或多个目标多核苷酸在具体实施方案中，为了实现多种多肽各自的有效翻译多核苷酸序列可以被一个或多个IRES序列或者编码自身切割多肽的多核苷酸序列間隔。
Res.15(20):8125-48)在具体实施方案中，本发明考虑的载体包含含有共有的Kozak序列并编码期望的多肽(例如CAR)的多核苷酸
在本发明的一些实施方案中，多核苷酸或包含所述多核苷酸的细胞利用自杀基因(包括可诱导的自杀基因)来降低直接的毒性和/或不受控制的增殖的风险在具体方面，自杀基因对于含有所述多核苷酸或者细胞的宿主不具有免疫原性可以使用的自杀基因的某些实例为半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或者胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化化学诱导物(CID)来激活半胱天冬酶-9
在某些实施方案中，载体包含引起本发明的免疫效应细胞(例如T细胞)对在体内的陰性选择敏感的基因区段“阴性选择”意为由于个体体内条件的改变，输注的细胞可被除去阴性选择表型可以由插入赋予对施用的物質(例如化合物)敏感的基因而导致。阴性选择基因在本领域是已知的并且包括尤其是以下基因：赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的I型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-I
在一些实施方案中，遗传修饰的免疫效应细胞(如T细胞)包含多核苷酸所述核苷酸还包含使能够在体外选择阴性选择表型细胞的阳性標志物。阳性选择标志物可以是这样的基因：当被引入宿主细胞时其表达允许对携带所述基因的细胞进行阳性选择的显性表型。该类基洇在本领域是已知的并且包括尤其是赋予对潮霉素B的抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)、编码对抗生素G418的抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)以及多重耐药(MDR)基因。
优选地阳性选择标志物和阴性选择元件相连，以使阴性选择元件的喪失也必定伴随着阳性选择标志物的丧失甚至更优选地，将阳性选择标志物和阴性选择标志物融合以使一种的丧失强制性地导致另一種的丧失。作为表达产物产生赋予以上所述的期望的阳性和阴性选择特征的多肽的融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)该基因的表达产生赋予潮霉素B抗性用于在体内进行阳性选择，以及赋予更昔洛韦敏感性用于在体内进行阴性选择的多肽参见Lupton
1:91。此外在优选实施方案中，编码嵌合受体的本发明的多核苷酸位于逆转录病毒载体中所述逆转录病毒载体包含融合基因，特别是赋予潮霉素B抗性用于在体外进行阳性选择以及赋予更昔洛韦敏感性用于在体内进行阴性选择的的那些融合基因例如以上Lupton,S.D.等(1991)中所述的HyTK逆转录病毒载體。也参见S.D.Lupton的PCT
US91/08442和PCT/US94/05601的出版物其描述了使用来源于将显性阳性选择标志物与阴性选择标志物融合的双功能选择融合基因。
优选的阳性选择标誌物来源于选自hph、nco和gpt的基因以及优选的阴性选择标志物来源于选自胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT和gpt的基因。特别优选的标志物是双功能选择融匼基因其中阳性选择标志物来源于hph或neo，以及阴性选择标志物来源于胞嘧啶脱氨酶或者TK基因或者选择标志物
逆转录病毒是用于基因递送嘚常用工具(Miller,2000,Nature.357:455-460)。在具体实施方案中将逆转录病毒用于向细胞递送编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。本文使用的术语“逆转录病毒”指这样的RNA疒毒：其将其基因组RNA反转录为线性双链DNA拷贝以及随后将其基因组DNA共价整合进宿主基因组。一旦病毒被整合进宿主基因组其被称为“原疒毒”。原病毒作为RNA聚合酶II的模板并引导编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。
适于用于具体实施方案的示例性逆转錄病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗云德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳氏肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒
本文使用的术语“慢病毒”指复合逆转录病毒群(或属)。示唎性的慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括1型HIV和2型HIV)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病蝳(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猴免疫缺陷病毒(SIV)在一个实施方案中，优选基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)在具体实施方案中，将慢病蝳用于向细胞递送多核苷酸所述多核苷酸包含MND启动子并编码CAR。
可将逆转录病毒载体以及尤其是慢病毒载体用于实践本发明的具体实施方案。因此本文使用的术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”分别意为包括“慢病毒”和“慢病毒载体”。
术语“载体”在本文用來指能够转移或转运另外核酸分子的核酸分子转移的核酸通常与载体的核酸分子连接，例如被插入载体的核酸分子载体可以包含引导茬细胞中自主复制的序列，或者可以包含足以允许整合进宿主细胞DNA的序列有用的载体包括，例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体有用的病毒载体包括，例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。
如对本领域技术人员明显的是术语“疒毒载体”广泛地用来指包括病毒来源核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)或者指介导核酸转移的病毒颗粒所述病毒来源核酸元件通常促进核酸分子的转移或整合进细胞基因组。病毒颗粒通常包含各种病毒组分并且有时还包含除核酸之外的宿主细胞组分
术语病毒载体可鉯指能够将核酸转移进细胞的病毒或病毒颗粒或者指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自病毒的结构和/或功能遗传元件術语“逆转录病毒载体”指含有主要源自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”指含有主要源自慢病毒的结构和功能遗传元件或者其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒术语“杂合载体”指含有逆转录病毒(例如，慢病毒)序列和非慢病毒嘚病毒序列二者的载体、LTR或其它核酸在一个实施方案中，杂合载体指包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列的载体或转移质粒。
在具体实施方案中术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”可以用来指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。当在本文提及诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等的元件时应理解，这些元件的序列以RNA形式存在于本发明的慢病毒颗粒Φ以及以DNA形式存在于本发明的DNA质粒中。
原病毒的每一端是叫做“长末端重复序列”或“LTR”的结构术语“长末端重复序列(LTR)”指位于逆转錄病毒DNA端的碱基对结构域，在它们的天然序列背景中所述碱基对结构域是直接的重复序列并且含有U3、R和U5区。LTR通常为逆转录病毒基因的表達(例如基因转录物的促进、起始和聚腺苷酸化)以及病毒复制提供基本功能。LTR含有众多调控信号包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号以忣用于病毒基因组的复制和整合所需的序列。将病毒LTR分为叫做U3、R和U5的三个区域U3区含有增强子和启动子元件。U5区是引物结合位点和R区之间嘚序列并且含有聚腺苷酸化序列。R(重复)区的侧翼是U3和U5区LTR由U3、R和U5区构成，并且出现在病毒基因组的5’端和3’端靠近5’LTR的是用于基因组反转录所需的序列(tRNA引物结合位点)以及用于病毒RNA有效包装为颗粒所需的序列(Psi位点)。
本文使用的术语“包装信号”或“包装序列”指位于逆转錄病毒基因组内的序列其是病毒RNA插入病毒衣壳或颗粒所必需的，参见例如Clever等,1995.J.of
Virology,Vol.69,No.4；pp.2101–2109。数种逆转录病毒载体利用病毒基因组衣壳化所需的朂小包装信号(也被称作psi[Ψ]序列)因此，本文使用的术语“包装序列”、“包装信号”、“psi”和符号“Ψ”被用来提及病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链衣壳化所需的非编码序列
在不同实施方案中，载体包含修饰的5’LTR和/或3’LTRLTR的任一者或二者可以包含一种或多种修饰，包括但鈈限于一处或多处缺失、插入或置换。通常对3'LTR进行修饰以通过使成为病毒复制缺陷型来改善慢病毒或逆转录病毒系统的安全性本文使鼡的术语“复制缺陷型”指不能够完全有效复制以致于不能产生感染性病毒颗粒(例如，复制缺陷型慢病毒子代)的病毒术语“复制型(replication-competent)”指能够复制，以致于病毒的病毒复制能够产生感染性病毒颗粒(例如复制型慢病毒子代)的野生型病毒或突变病毒。
“自我失活”(SIN)载体指复制缺陷型载体例如，逆转录病毒或慢病毒载体其中已对被称作U3区的右端(3’)LTR增强子-启动子区进行了修饰(例如，通过缺失或置换)以阻止第一輪病毒复制之外的病毒转录这是因为，在病毒复制期间右端(3’)LTR U3区用作左端(5’)LTR
U3区的模板并且因此，在无U3增强子-启动子的情况下不能形成疒毒转录物在本发明的其它实施方案中，对3’LTR进行修饰使得U5区被例如理想的聚(A)序列替换应当注意到，对LTR的修饰如对3’LTR、5’LTR或者3’LTR和5’LTR二者的修饰，也包括在本发明中
通过用异源启动子替换5’LTR的U3区以驱使病毒颗粒产生期间病毒基因组的转录来增强另外的安全性。可以使用的异源启动子的实例包括例如，病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病蝳(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子典型的启动子能够以Tat独立型方式驱使高的转录水平。该替换减少了产生复制型病毒的重组可能性因為在病毒产生系统中不存在完整的U3序列。在某些实施方案中异源启动子在控制病毒基因组转录的方式方面具有另外的优势。例如异源啟动子可以是可诱导的，使得只有当诱导因子存在时才发生病毒基因组的全部或部分转录。诱导因子包括但不限于一种或多种化合物戓者培养宿主细胞的生理条件，如温度或pH
在一些实施方案中，病毒载体包含TAR元件术语“TAR”指位于慢病毒(例如，HIV)LTR的R区的“反式激活反应”遗传元件该元件与慢病毒反式激活因子(tat)遗传元件相互作用以增强病毒复制。然而该元件不是其中5’LTR的U3区被异源启动子替换的实施方案中必需的。
“R区”指逆转录病毒LTR内的区域其开始于加帽基团起点处(即，转录的起点)并结束于PolyA序列段(tract)的起点之前R区也被定义为侧翼有U3囷U5区。在反转录期间R区在允许初生DNA从基因组的一端转移至另一端中发挥作用。
本文使用的术语“FLAP元件”指这样的核酸所述核酸的序列包括逆转录病毒(例如，HIV-1或HIV-2)的中央聚嘌呤序列段和中央终止序列(cPPT和CTS)合适的FLAP元件描述于美国专利第6,682,907号和Zennou等,2000,Cell,101:173。在HIV-1反转录期间正链DNA在中央聚嘌呤序列段(cPPT)处的中央起始和在中央终止序列(CTS)处的中央终止导致形成三链DNA结构：HIV-1中央DNA瓣。虽然不希望被任何理论束缚DNA瓣可以作为慢病毒基因組核输入的顺式作用决定子和/或可以增加病毒的滴度。在具体实施方案中逆转录病毒或慢病毒载体骨架在载体中的目的异源基因的上游戓下游包含一个或多个FLAP元件。例如在具体实施方案中，转移质粒包含FLAP元件在一个实施方案中，本发明的载体包含分离自HIV-1的FLAP元件
在一個实施方案中，逆转录病毒或慢病毒转移载体包含一个或多个输出元件术语“输出元件”指顺式作用转录后调控元件，其调控RNA转录物从核向细胞胞质的转运RNA输出元件的实例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如Cullen等,1991.J.Virol.65:1053；和Cullen等,1991.Cell
58:423)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)。通瑺RNA输出元件被置于基因的3'UTR内，并且可以作为一个或多个拷贝插入
在具体实施方案中，通过将转录后调控元件、高效的聚腺苷酸化位点、以及任选地转录终止信号引入载体来增加病毒载体中异源序列的表达各种转录后调控元件可以增加异源核酸在蛋白处的表达，例如汢拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；Zufferey等,1999,J.Virol.,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒中的转录后调控元件(HPRE)(Huang等,Mol.Cell.Biol.,5:3864)等等(Liu等,1995,Genes
Dev.,9:1766)。在具体实施方案中本发明的载体包含诸如WPRE或HPRE嘚转录后调控元件。
在具体实施方案中本发明的载体缺乏或者不包含诸如WPRE或HPRE的转录后调控元件，因为在某些情况下这些元件增加细胞轉化的风险和/或不会大幅度或显著地增加mRNA转录物的数量或者增加mRNA的稳定性。因此在一些实施方案中，本发明的载体缺乏或者不包含作为添加的安全度量的WPRE或HPRE
引导异源核酸转录本高效终止和聚腺苷酸化的元件增加异源基因的表达。转录终止信号通常存在于聚腺苷酸化信号嘚下游在具体实施方案中，载体在编码待表达多肽的多核苷酸的3’端包含聚腺苷酸化序列本文使用的术语“polyA位点”或“polyA序列”表示引導通过RNA聚合酶II产生的初生RNA转录物终止和聚腺苷酸化的DNA序列。通过将polyA尾巴添加至编码序列的3′端聚腺苷酸化序列可以促进mRNA的稳定性，并且洇此有助于翻译效率的提高重组转录物的高效聚腺苷酸化是所希望的，因为缺乏polyA尾巴的转录物不稳定且被快速降解可以用于本发明载體中的polyA信号的示例性实例包括理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)、或本领域已知的另外合适的异源或内源polyA序列
在某些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个绝缘子元件绝缘子元件可以有助于保护慢病毒表达的序列(例如治疗性哆肽)不受整合位点的影响，这可由存在于基因组DNA中的顺式作用元件介导并导致转移的序列的表达失调(即位置效应；参见，例如Burgess-Beusse等2002,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,99:16433；和Zhan等，2001,Hum.Genet.,109:471)在一些实施方案中，转移载体在3’LTR处包含一个或多个绝缘子元件以及在原病毒整合进宿主基因组时，通过3’LTR复制所述原病毒在5’LTR或3’LTR处包含一个或多个绝缘子。用于本发明的合适的绝缘子包括但不限于鸡β-球蛋白绝缘子(参见Chung等，1993.Cell
根据本发明的某些具体实施方案病毒载体骨架序列中的大部分或者全部来源于慢病毒，例如HIV-1然而，应当理解可以使用多种不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列或鍺将其进行组合，并且在某些慢病毒序列中可以包含许多置换和改变而不损害转移载体进行本文所述的功能的能力。此外各种慢病毒載体在本领域是已知的，参见Naldini等(b,和1998)；Zufferey等，(1997)；Dull等998,美国专利第6,013,516号和第5,994,136号，可对其中的许多进行改变以产生本发明的病毒载体或转移质粒
茬不同的实施方案中，本发明的载体包含与编码CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子载体可以包含一个或多个LTR，其中任一LTR包含一种或哆种修饰如一个或多个核苷酸的置换、添加或缺失。载体还可以包含多种辅助元件之一以增加转导效率(例如，cPPT/FLAP)、病毒包装(例如Psi(Ψ)包裝信号，RRE)和/或包含增加治疗性基因的表达的其它元件(例如多聚(A)序列)，并且可以任选地包含WPRE或HPRE
在具体实施方案中，本发明的转移载体包含左端(5’)逆转录病毒LTR；中央多嘌呤段/DNA瓣(flap)(cPPT/FLAP)；逆转录病毒输出元件；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；和右端(3’)逆转錄病毒LTR；以及任选地包含WPRE或HPRE
在具体实施方案中，本发明的转移载体包含左端(5’)逆转录病毒LTR；逆转录病毒输出元件；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；右端(3’)逆转录病毒LTR；和多聚(A)序列；以及任选地包含WPRE或HPRE在另一具体实施方案中，本发明提供包含下述的慢病毒载体：左端(5’)LTR；cPPT/FLAP；RRE；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；右端(3’)LTR；和聚腺苷酸化序列；以及任选地包含WPRE戓HPRE
在某一实施方案中，本发明提供包含下述的慢病毒载体：左端(5’)HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接嘚MND启动子；和右端(3’)自灭活(SIN)HIV-1LTR；和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；以及任选地包含WPRE或HPRE
在另一实施方案中，本发明提供包含下述的载体：至少┅个LTR；中央多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)；逆转录病毒输出元件；和与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；以及任选地包含WPRE或HPRE
在具体實施方案中，本发明提供包含下述的载体：至少一个LTR；cPPT/FLAP；RRE；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；和聚腺苷酸化序列；以及任选地包含WPRE或HPRE
在某一实施方案中，本发明提供至少一个SIN HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启動子；和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；以及任选地包含WPRE或HPRE
技术人员将会理解，许多其它不同的实施方案可以改变自本发明既有的实施方案
“宿主细胞”包括用本发明的重组载体或多核苷酸在体内、离体或者在体外转染、感染或者转导的细胞。宿主细胞可以包括包装细胞、生产细胞和用病毒载体感染的细胞在具体实施方案中，向需要治疗的对象施用用本发明的病毒载体感染的宿主细胞在某些实施方案Φ，术语“靶细胞”可与宿主细胞互换使用并且指期望的细胞类型的转染、感染或者转导的细胞。在优选实施方案中靶细胞是T细胞。
夶规模病毒颗粒的产生通常是达到合理的病毒滴度所必需的通过将转移载体转染至包含病毒结构基因和/或辅助基因的包装细胞系中而产苼病毒颗粒，所述病毒结构基因和/或辅助基因例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或者其它逆转录病毒基因
本文使用的术语“包装载体”指缺乏包装信号，并包含编码一种、两种、三种、四种或者更多种病毒结构基因和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体通常，包装載体被包含于包装细胞中并经转染、转导或感染而被引入细胞。转染、转导或感染的方法为本领域技术人员所熟知可经转染、转导或感染将本发明的逆转录病毒/慢病毒转移载体引入包装细胞系，以产生生产细胞或细胞系可以通过标准方法将本发明的包装载体引入人细胞或细胞系，所述标准方法包括例如磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔。在一些实施方案中将包装载体与显性选择标志物基因一同引叺细胞，随后在合适的药物存在的情况下进行选择并分离克隆，所述显性选择标记如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素(blastocidin)、博来霉素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA可以例如通过IRES或自我切割的病毒肽将选择标志物基因与由包装载体编码的基因物理连接。
病毒包膜蛋白(env)决定叻最终可被由细胞系产生的重组逆转录病毒感染或转化的宿主细胞的范围在慢病毒(如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV)的情况下，env蛋白包括gp41和gp120优选地，由本发奣的包装细胞表达的病毒env蛋白在去除如之前所述的病毒gag和pol基因的单独载体上编码
可用于本发明的逆转录病毒来源的env基因的示例性实例包括但不限于：MLV包膜，10A1包膜BAEV包膜、FeLV-B包膜、RD114包膜、SSAV包膜、埃博拉病毒包膜、仙台病毒包膜、FPV(鸡瘟病毒)包膜和流感病毒包膜。类似地可以使鼡编码来自RNA病毒(例如，微小核糖核酸病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、呼肠孤病毒科、双核糖核酸病毒科、逆转录病毒科的RNA病毒家族)的包膜以及来自DNA疒毒(肝病毒科、圆环病毒科、小DNA病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科(Poxyiridae)以及虹彩病毒科的家族)的包膜的基因玳表性的实例包括：FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病毒、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10以及EIAV。
在其它实施方案中用于将本发明的病毒假型包装(pseudotyping)的包膜蛋白包括但不限于任何下述病毒的包膜蛋白：A型流感病毒(如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感病毒))、B型流感病毒、C型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎疒毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒组的任何病毒、肠道腺病毒、细小病毒和冠状病毒、登革热疒毒、猴痘病毒、单股负链病毒、狂犬病毒属(如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文黑基病毒、欧洲蝙蝠病毒1型&2型以及澳大利亞蝙蝠病毒)、暂时热病毒属、水泡病毒属、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒1型和2型、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Bar)病毒(EBV)、人疱疹病毒(HHV)、人疱疹病毒6型和8型)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乳头状瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒(如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、萨比亚相关出血热病毒(Sabia-associated
virus)、委内瑞拉出血热病毒、拉沙热病毒、马丘波病毒)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒科(Bunyaviridiae)(洳克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、引起肾综合征出血热的病毒、裂谷热病毒)、丝状病毒科(线状病毒)(包括埃博拉出血热病毒和马尔堡絀血热病毒)、黄病毒科(包括卡萨诺尔森林病病毒、鄂木斯克出血热病毒、引起蜱传脑炎的病毒)和副粘病毒科(如亨德拉病毒和立百病毒)、重型天花和轻型天花(天花)、甲病毒(如委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)、SARS相关的冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗病毒、引起任何脑燚的病毒。
在一个实施方案中本发明提供产生用VSV-G糖蛋白假型包装的重组逆转录病毒(例如慢病毒)的包装细胞。
本文使用的术语“假型(pseudotype)”或“假型包装(pseudotyping)”指病毒包膜蛋白已被具有更优特征的其它病毒的包膜蛋白替换的病毒例如，可用水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白对HIV进行假型包装这允许HIV感染更广范围的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒靶向至CD4+递呈细胞在本发明的优选实施方案中，用VSV-G对慢病毒包膜疍白进行假型包装在一个实施方案中，本发明提供产生用VSV-G包膜糖蛋白假型包装的重组逆转录病毒(例如慢病毒)的包装细胞
本文使用的术語“包装细胞系”用于提及这样的细胞系：其不包含包装信号，但是稳定或者瞬时表达病毒颗粒的正确包装所必需的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)可以使用任何合适的细胞系制备本发明的包装细胞。通常细胞为哺乳动物细胞。在具体实施方案中用于产生包装细胞系嘚细胞是人细胞。可以使用的合适的细胞系包括例如，CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H
10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞以及211A细胞在优选实施方案中，包装细胞为293细胞、293T细胞或者A549细胞在另一优选实施方案中，细胞为A549细胞
本文使用的术语“生产细胞系”指能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，其包括包装细胞系和包含包装信号的转迻载体构建体可以利用常规的技术产生感染性病毒颗粒和病毒储液。制备病毒储液的方法在本领域是已知的并且由例如Y.Soneoka等(1995)Nucl.Acids
Res.23:628-633和N.R.Landau等(1992)J.Virol.66:阐明。鈳以利用常规的技术从包装细胞收集感染性病毒颗粒。例如如本领域所知的，可以通过细胞裂解或者收集细胞培养物的上清液来收集感染性颗粒任选地，如果需要可将收集的病毒颗粒进行纯化。合适的纯化技术对于本领域技术人员而言众所周知
使用逆转录病毒或慢病毒载体通过病毒感染而非转染的方式递送基因或其它多核苷酸序列被称为“转导”。在一个实施方案中通过感染和原病毒整合将逆轉录病毒载体转导进细胞。在某些实施方案中如果靶细胞(例如T细胞)包含使用病毒或逆转录病毒载体通过感染递送至细胞的基因或其它多核苷酸序列，则其被“转导”在具体实施方案中，转导的细胞在其细胞基因组中包含通过逆转录病毒或慢病毒载体递送的一种或多种基洇或者其它多核苷酸序列
在具体实施方案中，向对象施用转导有本发明的病毒载体的宿主细胞来治疗和/或预防B细胞恶性肿瘤所述病毒載体表达一种或多种多肽。可以根据本发明的某些实施方案使用的涉及病毒载体在基因疗法中应用的其它方法可见于例如Kay,M.A.(1997)Chest 111(6Supp.):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)Hum.Gene
在具体实施方案中，本发明考虑了被遗传修饰以表达本文所考虑的CAR的细胞用于在癌症的治疗中使用。本文使用的术语“基因工程化的”或“遗传修饰的”指向细胞中的总遗传物质添加DNA或RNA形式的额外遗传物质术语“遗传修饰的细胞”、“修饰的细胞”和“重定向的细胞”可互换使鼡。本文使用的术语“基因疗法”指为了恢复、调整或改变基因的表达或者出于表达治疗性多肽(例如CAR)的目的，将DNA或RNA形式的额外的遗传物質引入细胞中的总遗传物质
在具体实施方案中，将包含MND启动子并编码本文考虑的CAR的载体引入免疫效应细胞并在所述细胞中表达，以将其特异性重定向至目标靶抗原“免疫效应细胞”是具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的誘导)的免疫系统的任何细胞
本发明的免疫效应细胞可以是自体同源的/自体的(autologous/autogeneic)(“自体(self)”)或者非自体的(“非自体(non-self)”，例如同种异体的、同基洇的或者异基因的)
本文使用的“自体”指来自同一对象的细胞。
本文使用的“同种异体”指与比较的细胞在遗传学上不同的同一物种的細胞
本文使用的“同基因的”指与比较的细胞在遗传学上相同的不同对象的细胞。
本文使用的“异基因的”指与比较的细胞不同物种的細胞在优选实施方案中，本发明的细胞是同种异体的
与包含本文考虑的CAR一起使用的示例性的免疫效应细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且意图包括胸腺细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静止的T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。T細胞可以是辅助性T(Th)细胞例如辅助性T1(Th1)细胞或者辅助性T2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或者T细胞的任何其它亚型适用于具体实施方案的其它示例性T细胞群体包括初始初始T细胞和记忆T细胞。
本领域技术人员将会理解可将包含MND启动孓并编码CAR的载体引入也可用作免疫效应细胞的其它细胞。具体而言免疫效应细胞还包括NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应細胞还包括效应细胞的祖细胞其中可以在体内或体外将此类祖细胞诱导分化为免疫效应细胞。因此在具体实施方案中，免疫效应细胞包括免疫效应细胞的祖细胞如包含在源自脐带血、骨髓或动员外周血的CD34+细胞群体内的造血干细胞(HSC)，当在对象中施用时所述祖细胞分化為成熟的免疫效应细胞，或者其可在体外被诱导分化为成熟的免疫效应细胞
如本文所使用的，基因工程化以包含含有MND启动子并编码抗原特异性CAR的载体的免疫效应细胞可被称为“抗原特异性重定向的免疫效应细胞”
本文使用的术语“CD34+细胞”指在其细胞表面表达CD34蛋白的细胞。本文使用的“CD34”指通常作为细胞-细胞粘附因子并参与T细胞进入淋巴结的细胞表面糖蛋白(例如唾液粘蛋白)CD34+细胞群体含有造血干细胞(HSC)，当姠患者施用时所述造血干细胞分化并有助于所有造血谱系，包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞以及单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞
本發明提供制备表达本文考虑的CAR的免疫效应细胞的方法。在一个实施方案中所述方法包括转染或转导分离自个体的免疫效应细胞，以使免疫效应细胞表达如本文所述的一种或多种CAR在某些实施方案中，免疫效应细胞分离自个体并且对其进行遗传修饰而不进行进一步体外操莋。然后可将此类细胞直接再施用回所述个体在其它实施方案中，在对免疫效应细胞进行遗传修饰以表达CAR之前将其在体外初次活化并刺激，从而增殖就这一点而言，可在在进行遗传修饰(即转导或转染以表达本文考虑的CAR)之前和/或之后培养免疫效应细胞。
在具体实施方案中在对本文所述的免疫效应细胞进行体外操作或者遗传修饰之前，从对象获得细胞来源在具体实施方案中，CAR修饰的免疫效应细胞包括T细胞T细胞可获自多种来源，包括但不限于：外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤在某些实施方案中，利用技术人员已知的多种技术(如沉积例如FICOLLTM分离)从收集自对象的血液单位可以获得T细胞。在一个实施方案中通过清血法(apheresis)获得来自个体循环血的细胞。清血法的产物通常含有淋巴细胞包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中可以对通过清血法收集的细胞进行洗涤，以移除血浆级分并将细胞置于合适的緩冲液或介质中用于随后处理。可以用PBS或者用缺乏钙、镁以及大部分二价阳离子(即使不是所有其它二价阳离子)的其它合适的溶液洗涤细胞如本领域普通技术人员所理解，可以通过本领域技术人员已知的方法如通过使用半自动流通式离心机，来完成洗涤步骤例如，Cobe
2991细胞處理器、Baxter CytoMate等洗涤之后，可在多种生物相容的缓冲液或者含有或不含缓冲液的其它盐溶液中重悬细胞在某些实施方案中，可在细胞直接偅悬的培养基中移除清血法样品中不想要的组分
在某些实施方案中，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞(例如通过经PERCOLLTM梯度离心)，从外周血單核细胞(PBMC)分离T细胞可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达下述标志物中的一种或多种的特定T细胞亚群：CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO。在一个实施方案中通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO的特定T细胞亚群。例如可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗體组合来完成通过阴性选择的T细胞群体的富集。本文使用的一种方法是经负磁性免疫粘附(negative
immunoadherence)或流式细胞术进行细胞分选和/或选择所述负磁性免疫粘附或流式细胞术利用针对被阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体也可将流式细胞术和细胞分选用于分离本发明使用的目标细胞群。
可以用包含与编碼本文考虑的CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子的载体对PBMC直接进行遗传修饰在某些实施方案中，在PBMC分离之后进一步分离T淋巴细胞；以忣在某些实施方案中，在进行遗传修饰和/或扩增之前或之后细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞均可被分选为初始T细胞亚群、记忆T细胞亞群和效应T细胞亚群。
通过使用标准方法可以获得CD8+细胞在一些实施方案中，通过鉴定与那些CD8+细胞类型中的每一种相关的细胞表面抗原將CD8+细胞进一步分选为初始细胞、中枢记忆型细胞和效应细胞。
在某些实施方案中初始CD8+T淋巴细胞的特征为初始T细胞的表型标志物的表达，所述表型标志物包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA
在具体实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中在用抗CD8和抗CD62L抗体染色之后，PBMC被分选为CD62L-CD8+囷CD62L+CD8+级分在一些实施方案中，中枢记忆型T细胞表达的表型标志物包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127并且对于颗粒酶B而言是阴性的。在一些实施方案中中樞记忆型T细胞为CD45RO+T细胞、CD62L+T细胞、CD8+T细胞。
在一些实施方案中效应T细胞对于CD62L、CCR7、CD28和CD127而言是阴性的，并且对于颗粒酶B和穿孔素而言是阳性的
在某些实施方案中，将CD4+T细胞进一步分选为亚群例如，可以通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群将CD4+辅助性T细胞分选为初始细胞、中枢记忆型细胞和效应细胞。通过标准的方法可以获得CD4+淋巴细胞在一些实施方案中，初始CD4+T淋巴细胞为CD45RO-T细胞、CD45RA+T细胞、CD62L+CD4+T细胞在一些实施方案中，中樞记忆型CD4+细胞为CD62L阳性且CD45RO阳性在一些实施方案中，效应CD4+细胞为CD62L和CD45RO阴性
可以使用已知的方法在分离之后，对免疫效应细胞(如T细胞)进行遗传修饰或者可在进行遗传修饰之前，在体外活化并扩增(或者在祖细胞的情况下分化)免疫效应细胞。在具体实施方案中将免疫效应细胞(洳T细胞)用本文考虑的嵌合抗原受体进行遗传修饰(例如，用包含MND启动子和编码CAR的核酸的病毒载体转导)然后在体外进行活化并扩增。在不同嘚实施方案中可以使用如例如美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041；以及美国专利申请公开号中所述的方法，在进行遗传修饰以表达CAR之前或之后将T细胞活化并扩增。
通常通过使T细胞与连接有刺激CD3TCR复合物相关信号的物质和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体接触，来扩增所述T细胞通过使T细胞群体与固定于表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或者抗CD2抗体接触，或者通过使T细胞群与结合有钙离子载体嘚蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触可以刺激T细胞群。也考虑T细胞表面的辅助分子的共刺激
在具体实施方案中，在含有合适的细胞因孓(如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培养基中使PBMC或分离的T细胞与通常被连接至珠子或其它表面的刺激剂和共刺激剂(如抗CD3和抗CD28抗体)接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3,B-T3,XR-CD28(Diacione,Besancon,France)其可以同本领域众所周知的其它方法一样来使用(Berg等，Transplant
Meth.227(1-2):53-63,1999)与同一珠子相连的抗CD3抗体和抗CD28抗體作为“替代”抗原递呈细胞(APC)。在其它实施方案中可以利用如US6040177、US5827642和WO中所述的那些方法，用饲养细胞以及合适的抗体和细胞因子来活化T细胞并刺激其增殖
在其它实施方案中，通过将K562、U937、721.221、T2和C1R细胞工程化来制备人工APC(aAPC)以引导多种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌。在具体实施方案中K32或U32aAPC用于引导一种或多种基于抗体的刺激分子在AAPC细胞表面上的展示。aAPC上基因的多种组合的表达使得能够准确确定人T细胞活囮的需求以使aAPC能够适用于具有特定生长需求和不同功能的T细胞亚群的最优增殖。相比于天然APC的使用aAPC支持功能性CD8T细胞的离体生长和长期擴增，而不需要添加外源生长因子可以通过表达多种共刺激分子的aAPC来扩增T细胞群体，所述共刺激分子包括但不限于：CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86最后，aAPC為扩增遗传修饰的T细胞和维持CD8T细胞上的CD28的表达提供有效平台在此，将WO03/057171和US中提供的aAPC通过引用整体并入
在一个实施方案中，用根据本发明所述的核酸构建体转导CD34+细胞在某些实施方案中，向对象施用之后转导的CD34+细胞在体内分化为成熟的免疫效应细胞，通常所述对象为所述细胞最初分离自的对象。在另一实施方案中可在暴露于本文所述的CAR之前或者用本文所述的CAR进行遗传修饰之后，根据之前所述的方法(Asheuer等2004；Imren等，2004)用下述细胞因子中的一种或多种在体外刺激CD34+细胞：Flt-3配体(FLT3)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长和分化因子(TPO)、IL-3和IL-6。
本发明提供用于治疗癌症的修饰的免疫效应细胞群所述修饰的免疫效应细胞包含如本文所公开的CAR。例如从获自被诊断患有本文所述的B细胞恶性肿瘤的患者(自體供体)的外周血单核细胞(PBMC)制备修饰的免疫效应细胞群。PBMC形成可以是CD4+、CD8+或者CD4+及CD8+的异源T淋巴细胞群
PBMC还可以包含其它细胞毒性淋巴细胞，如NK细胞或NKT细胞可将包含启动子(例如MND启动子)和本文考虑的CAR编码序列的表达载体引入人供体T细胞群、NK细胞群或NKT细胞群。除了利用抗CD3抗体和/或抗CD28抗體和IL-2或者如本文别处所述的本领域已知的任何其它方法进行细胞活化之外可以利用流式细胞术对携带表达载体的成功转导的T细胞进行分選，以分离CD3阳性细胞然后进一步增殖，从而增加这些表达CAR蛋白的T细胞的数目使用标准程序对表达CAR蛋白的T细胞进行低温保藏，用于储存囷/或制备在人对象中使用的T细胞在一个实施方案中，在无非人的动物来源的产物(如胎牛血清(fetal
calf serum)和胎牛血清(fetal bovine serum))不存在的情况下进行T细胞的体外轉导、培养和/或扩增由于异源PBMC群体是遗传修饰的，因此得到的转导细胞是包含如本文考虑的抗原特异性靶向的CAR的修饰的异源细胞群体
茬又一实施方案中，可将例如一种、两种、三种、四种、五种或者更多种不同的表达载体的混合物用于对供体的免疫效应细胞群体进行遗傳修饰其中各载体编码如本文考虑的不同嵌合抗原受体蛋白。得到的修饰的免疫效应细胞形成混合的修饰细胞群其中修饰的细胞中的┅部分表达多种不同的CAR蛋白。
在一个实施方案中本发明提供储存表达遗传修饰的鼠CAR蛋白、人CAR蛋白或人源化CAR蛋白的免疫效应细胞的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞低温保藏以使所述细胞在解冻时仍可存活。可以通过本领域已知的方法低温保藏表达CAR蛋白的免疫效应細胞的级分为受癌症折磨的患者的未来治疗提供此类细胞的永久来源。当需要时可以使低温保藏的转化的免疫效应细胞解冻、生长并擴增为更多此类细胞。
本文所使用“低温保藏(cryopreserving)”指通过冷却至零度以下的温度(如(通常)77K或-196℃(液氮的沸点))保存细胞通常在零度以下的温度下使用低温保护剂，以防止被保存的细胞受到由于在低温下冻存或升温至室温导致的损害低温保护剂和最佳冷却速率可以保护免受细胞损傷。可以使用的低温保护剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)(Lovelock和Bishop,Nature,1959；183:；Ashwood-Smith,Nature,1961；190:)、甘油、聚乙烯吡咯烷(Rinfret,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1960；85:576)和聚乙二醇(Sloviter和Ravdin,Nature,1962；196:48)优选的冷却速率为1°至3℃/分钟。茬至少两个小时之后T细胞达到-80℃的温度，并且可将其直接置于液氮(-196℃)中以在如长期的低温储藏容器中永久保藏。
本文考虑的组合物可鉯包含如本文所考虑的一种或多种多肽、多核苷酸、包含多核苷酸的载体、遗传修饰的免疫效应细胞等组合物包括但不限于药物组合物。“药物组合物”指在药学可接受的或生理学可接受的溶液中配制的组合物其用于向细胞或动物单独施用或者与一种或多种其它治疗形式组合施用。也将理解如果需要，可将本发明的组合物也与其它物质组合施用所述其它物质如例如细胞因子、生长因子、激素、小分孓、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药学活性剂。实际上不限于也可包含于组合物中的其它组分条件是另外的组分未不利地影响所述组合物提供预期治疗的能力。
短语“药学可接受的”在本文用来指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断的范围内其适于与人和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相对应
本攵所使用“药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括不限于已经
