技术领域 本发明涉及修饰纤维素酶 更具体地， 本发明涉及具有修饰连接肽的纤维素酶 所 述修饰连接肽赋予对木质素与所述修饰纤维素酶结合嘚抗性。 本发明还涉及包含编码所述 修饰纤维素酶的核酸序列的基因构建体 从宿主菌株中生产所述修饰纤维素酶的方法和用 所述修饰纤維素酶在木质素的存在下水解纤维素的方法。

     背景技术 地球上超过 50％的有机碳存在于植物细胞壁中植物细胞壁主要包含 3 种化合 物： 纤维素、 半纤维素和木质素。这些化合物共同被称为 “木质纤维素” 它们构成用于发酵 生产乙醇或其他高附加值产品的糖和其他有机分子的潛在来源。

     因为纤维质乙醇对环境有利以及可持续的性质 木质纤维素生物质转变为乙醇已 经成为正在兴起的能源政策的关键特征。对于纖维素转变有多种技术正在开发这里感 兴趣的是这样的方法， 即通过所述方法将木质纤维素生物质进行预处理以增加其对水解酶 的敏感性 之后使其酶水解为糖并将这些糖发酵为乙醇或其他高附加值的有机分子 ( 例 如， 丁醇 缺失或取代而被修饰并仍然被视为 CBM

    CBM 和糖基水解酶結构域通常由连接肽分开。术语 “连接肽” 应理解为位于两个功 能结构域之间并包含约 6 至约 60 个氨基酸的氨基酸片段所述两个功能结构域嘚实例包 括但不局限于 CBM 和糖基水解酶结构域， CBM 和扩展蛋白结构域 两个 CBM 以及两个糖基水 解酶结构域。结构域间连接肽可使用如 Bae 等 (2008) 和 Suyama 等 (2003) 描述嘚模型从 氨基酸序列信息确定Gilkes 等 (1991) 给出了该定义涵盖的来自多种纤维素酶以及其他 细菌和真菌蛋白质的连接肽序列。表 3 示出了来自里氏木黴的八种纤维素酶、 半纤维素酶 和相关蛋白质的连接肽的氨基酸序列还示出了每个所述连接肽的理论等电点 (pI) 和脯 氨酸和苏氨酸 / 丝氨酸的百分比。

     连接肽一般是碱性肽 其相对于非连接肽序列尤其富含丝氨酸、 苏氨酸和脯氨 酸。如 Gilkes 等 (1991) 的表 I 所示 脯氨酸、 丝氨酸和苏氨酸占来洎细菌和真菌糖基水 解酶 ( 木聚糖酶、 内切葡聚糖酶、 外切葡聚糖酶 ) 的全部连接肽序列中氨基酸的 50％或更 多。所述连接肽中的丝氨酸和苏氨酸可以被单糖、 二糖或低聚糖 ( 包括甘露糖或磷酸甘露 糖 (mannosylphosphate) 亚基 )O- 糖基化不意欲囿于任何理论， 苏氨酸∶丝氨酸比例的 升高可致使所述连接肽嘚糖基化程度增加 并且如果所述 O- 连接的糖类包含磷酸甘露糖 (mannosyl phosphate)， 则会增加所述连接肽的负电荷

     对于本发明的目的， 连接肽可被定义为 6-60 个氨基酸的片段 其中至少 50％是脯 氨酸、 丝氨酸或苏氨酸， 所述连接肽天然存在于糖基水解酶结构域和 CBM 之间、 两个糖基水 解酶结构域之间 兩个 CBM 之间或者另一个功能结构域与糖基水解催化结构域或 CBM 之间。 脯氨酸、 丝氨酸和苏氨酸可占所述连接肽中氨基酸的 50％、 60％、 70％、 80％、 90％戓 100％ ((# 脯氨酸 + 苏氨酸 + 丝氨酸 )/# 连接肽中的氨基酸 ×100％ )本领域技术人员理解给定 连接肽的氨基酸序列可通过一个或多个氨基酸的插入、 缺失或替换而被修饰并仍然被视为

     可通过将纤维素酶与纯化的木质素预孵育设定的时间然后使用本领域技术人员 已知的测定方法测量溶液中的残餘蛋白质浓度和 / 或酶活性来确定如上所定义的亲本或 修饰纤维素酶与木质素结合的程度。如果所述纯化的木质素是不可溶的 那么蛋白质 - 朩 质素复合物可容易地通过离心或过滤从含有未结合蛋白质的本体溶液中分离出来。 所述木 质素可通过酸提取、 碱提取、 有机溶剂提取或沝解酶对木质纤维素的酶消化从木质纤维素 原料 ( 下文描述 ) 中纯化亲本和修饰纤维素酶的相对结合的确定不依赖纯化所述纤维素 所用的方法、 木质素的来源或检测溶液中未结合纤维素酶所用的测定方法。测量亲本和修 饰纤维素酶的相对结合的方法在实施例 9 中提供

     所述修饰纖维素酶由木质素引起的失活的下降是通过测量在木质素存在和不存 在时纤维素底物的降解， 然后计算木质素存在时的活性与木质素不存茬时的活性的比例来 确定的存在于这种纤维素水解反应中的木质素可以是不可溶底物的一部分， 例如预处理 的木质纤维素中的不可溶底粅的一部分 或者被分离为可溶或不可溶形式。如果所述木质 素是分离的或纯化的 那么通过测量等同水解反应——其中反应之一包含足量的木质素以 降低纤维素酶活性——中纤维素酶的活性来确定由木质素引起的所述修饰或亲本纤维素 酶的失活。 或者 可以以与未经处理嘚木质素相同的量向对照反应加入分离的木质素， 所述 分离的木质素已通过包被非特异性蛋白 ( 如牛血清白蛋白 (BSA))、 表面活性剂或其他化学 物質而处理为灭活能力较小如果所述木质素是所述不可溶底物的一部分， 那么可通过计 算对经漂洗处理的底物 ( 已经从中除去木质素 例如通过氧化剂， 如二氧化氯 ) 的纤维素酶

     活性与对未经漂洗处理的含有木质素的底物的纤维素酶活性的比例来确定由木质素引起 的所述修饰或親本纤维素酶的失活 由木质素引起的失活下降的修饰纤维素酶会显示出高 于其亲本纤维素酶的活性比例 ( 未经处理的分离的木质素 ： 无木質素或经处理的木质素 )。

     存在一些本领域技术人员知晓的用于测量所述修饰和亲本纤维素酶的纤维素水 解活性的测定 例如， 可通过测量還原糖的酶依赖释放来监测纤维素的水解 所述还原糖的 酶依赖释放可通过本领域技术人员知晓的后续化学或化学酶学测定 ( 包括与二硝基沝杨 酸 (DNS) 反应 ) 来定量。多糖的水解还可通过分离并定量由所述酶活性释放的可溶单糖、 二糖和低聚糖的色谱法来监测此外， 可溶性比色底粅可被纳入在上面培养表达并分泌亲 本或修饰纤维素酶的宿主微生物的琼脂培养基中在这样的琼脂平板测定中， 所述纤维素 酶的活性作為表达并分泌活性纤维素酶的各个微生物菌落周围的有色或无色环被检测 但 是， 应理解本发明的实施并不受限于用于评估所述修饰纤维素酶的活性的方法实施例 9 中提供了用于测量本发明的修饰纤维素酶的纤维素水解活性的方法。

     可通过如实施例 6 和 7 所描述的对所述亲本和修饰纤维素酶的比较研究来确定多 种修饰连接肽对未经处理的木质素 (-BSA) 和处理的木质素 (+BSA) 存在时的木质素结合和 纤维素水解活性的作用 所述修饰连接肽具有降低所述连接肽的等电点或提高其苏氨酸∶ 丝氨酸比例的氨基酸替换。此外 如实施例 9 所描述确定亲本和包含所述修饰连接肽的修 饰纤维素酶与未经处理的木质素的结合。结果显示在下文表 4 中包含修饰连接肽的所有 修饰纤维素酶均显示出木质素结合的至少 20％的下降 ( 高 20％的 KL) 和 / 或未经处理的 木质素存在时的活性 ： 经 BSA 处理的木质素存在时的活性的比例的 11％的提高 (±BSA 活 性比例中 10％的提高 )。

     表4： 具有降低的 pI 和 / 或提高的苏氨酸∶丝氨酸比例的修饰连接肽对所得修饰 纤维素酶在木质素存在下的纤维素水解活性 (±BSA 比例 ) 和对木质素结合 ( 相对 KL) 的 效应

     本发明还涉及包含编码与调节核酸序列可操作地连接的所述修饰纤维素酶的核 酸序列的基因构建体， 所述调节核酸序列指导从宿主微生物表达和分泌所述修饰纤维素 酶术语 “调节核酸序列” 是指启动子和编码分泌信号肽的核酸序列。所述调节核酸序列 可来自于在工業发酵条件下在所述宿主微生物中高度表达和分泌的基因例如， 所述调节 核酸序列来自于任意一种或多种里氏木霉纤维素酶或半纤维素酶基因

     所述基因构建体还可包含选择性标记基因以能够如本领域技术人员所公知的分 离用所述构建体转化的基因修饰微生物。 所述选择性标记基因可赋予所述宿主生物体对抗 生素的抗性或能够在缺乏特定营养物质的培养基上生长的能力 所述宿主生物体原本不能 在这些条件下生长。本发明不受限于选择性标记基因的选择 并且本领域技术人员可以容 易地确定合适的基因。例如 所述选择性基因可赋予所述宿主微生物对潮霉素、 腐草霉素、 卡那霉素、 遗传霉素或 G418 的抗性， 补偿所述宿主微生物的 trp、 arg、 leu、 pyr4、 pyr、 ura3、

     所述基因构建体还可包含其他核酸序列 例如， 转录终止子、 编码肽标签的核酸序 列、 将多个核酸序列连接在一起的合成序列、 复制起始点等 本发明的实现并不受限于任意 一种或多种这些其他核酸序列的存在。

     所述修饰纤维素酶可从基因修饰微生物中表达并分泌 所述基因修饰微生物是通 过用编码所述修飾纤维素酶的基因构建体转化宿主微生物而产生的。所述宿主微生物可 以是细菌 例如大肠杆菌 (Eschericia coli) 或浅青紫链霉菌 (Streptomyces lividans) ； 酵母， 例如糖酵母属、 畢赤氏酵母属或汉逊氏酵母属 ； 或者是丝状真菌 例如木霉属、 肉座菌 属、 曲霉属、 镰刀菌属、 腐质霉属、 金孢子菌属、 毁丝霉属或链孢黴属。所述宿主微生物一般 是编码任意或全部亲本纤维素酶的基因缺失的微生物在一个最优选的实施方案中， 所述 宿主微生物是里氏木黴的一个工业菌株

)。选出表达所述修饰纤维素酶的重组真菌菌株后 可在诱导所述修饰纤维素 酶表达的条件下通过深层液体发酵培养所述选出的重组体。 所述修饰纤维素酶优选地在深 层液体培养发酵中产生并且在发酵结束时与所述细胞分离可通过过滤、 离心或本领域技 術人员熟知的其他方法将细胞分离。然后可将所得无细胞的含有糖苷酶的部分浓缩 ( 例 如 通过超滤 )、 防腐并且 / 或者稳定化，

     本发明的修饰纖维素酶用于在还包含木质素的水解反应中酶水解纤维素例如， 本发明的所述修饰纤维素酶用于例如在从木质纤维素生产可发酵糖、 糖醇或燃料酒精的工 业方法中 酶水解预处理的木质纤维素底物。本发明的修饰纤维素酶可以是包含其他纤维 素酶、 半纤维素酶、 糖苷酶和巳知会改变纤维素结构的非水解蛋白质 ( 例如膨胀素和扩展 蛋白 )

     术语 “酶水解” 是指糖苷酶或混合物 ( 包括包含本发明的修饰纤维素酶的那些糖 苷酶或混合物 ) 作用于多糖以将其全部或部分转化为可溶性糖的过程

     本发明的修饰纤维素酶可用于酶水解 “预处理的木质纤维素底物” 嘚过程中。 预处 理的木质纤维素底物是来源于植物的材料 所述材料在预处理之前包含至少 20％的纤维素 ( 干重 )， 更优选超过约 30％的纤维素 甚至更优选超过 40％的纤维素， 例如 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90％或其间的任意％的 纤维素， 并且包含至少 10％的朩质素 ( 干重 ) 更常见为至少 12％ ( 干重 ) 的木质素， 并且 所述材料已经用物理和 / 或化学方法处理使得其纤维更容易被纤维素酶的作用达到并且 / 或鍺接受

     在预处理过后， 所述木质纤维素原料可包含更高水平的纤维素 例如， 如果使用了 酸处理 那么所述半纤维素组分被水解， 这增加了纤维素的相对水平在这种情况下， 所述 预处理的原料可包含大于约 20％的纤维素和大于约 10％的木质素例如， 所述预处理的木 质纤维素原料包含大于约 20％的纤维素和大于约 12％的木质素可用于本发明的木质纤维素原料包括但不局限于农业残余物， 如玉米秸秆、 小麦 秸秆、 大麦秸秆、 稻秸秆、 燕麦秸秆、 加拿大油菜秸秆和大豆秸秆 ； 纤维处理残余物 如玉米 纤维、 甜菜浆液、 纸浆磨碎细粉 (pulp mill fine) 和废渣或者甘蔗渣 ； 森林残余物， 例如山 杨木、 其他硬木、 软木和锯末 ； 草 例如柳枝稷 (switchgrass)、 芒草

     首先将所述木质纤维素原料进行粉碎， 使用的方法包括但鈈局限于磨、 碾、 搅动、 切碎、 挤压 / 拉伸或其他机械作用类型可用适用于粉碎目的的任意类型的设备来进行机 械作用的粉碎， 所述设备唎如但不局限于锤式粉碎机

     预处理方法的非限制性实例包括用以下物质化学处理木质纤维素原料 ： 硫酸或、 亚硫酸或其他酸 ； 氨水、 石咴、 氢氧化铵或其他碱 ； 乙醇、 丁醇或其他有机溶剂 ； 或者加压水 ( 参见美国专利 No.4,461,648、 5,916,780、 6,090,595、 6,043,392、 4,600,590 ； 其以引用的 方式纳入本文

     可进行所述预处理以將存在于所述木质纤维素原料中的半纤维素或其一部分水 解为单糖， 例如木糖、 阿拉伯糖、 甘露糖、 半乳糖或其结合物 优选地进行所述預处理以使所 述半纤维素几近完全水解并且少量纤维素转变为葡萄糖。在所述预处理过程中 用于处理 所述木质纤维素原料的水性浆液中嘚酸浓度一般是约 0.02％ (w/w) 至约 2％ (w/w)， 或其间 的任意量所述酸可以是但不局限于盐酸、 硝酸、 亚硫酸 ( 包括加入二氧化硫或者二氧化硫 和水 )、 磷酸戓硫酸。例如 在预处理过程中使用的酸可以是硫酸。

     对 所 述 原 料 进 行 酸 预 处 理 的 一 种 方 法 是 蒸 汽 爆 发 其使用美国专利 No.4,461,648(Foody， 该专利以引用嘚方式纳入本文 ) 描述的处理条件预处理所述 原料浆液的另一种方法涉及连续预处理， 其含义是将所述木质纤维素原料连续泵过反应 器連续酸预处理是本领域技术人员熟知的 ； 参见， 例如

     如上所述， 可用碱进行预处理 与酸预处理不同， 用碱预处理不能水解所述原料中 嘚半纤维素组分 而是碱与存在于半纤维素上的酸性基团反应从而打开所述底物的表面。 碱的加入还可改变所述纤维素的晶体结构从而使其更容易被水解 可用于所述预处理的碱 的实例包括氨、 氢氧化铵、 氢氧化钾和氢氧化钠。优选不用不溶于水的碱 ( 例如石灰和氢氧 化镁

     合適的碱预处理的一个实例是氨冻结爆发 (Ammonia Freeze Explosion ； “AFEX” 法 ) 按照该方法， 使木质纤维素原料与氨或氢氧化铵在压力容器中接触足够的时间以使所 述氨或氢氧化铵改变所述纤维素纤维的晶体结构然后迅速降压， 这使得氨闪蒸 (flash) 或 沸 腾 并 使 得 所 述 纤 维 素 纤 维 结

     可用数种步骤的任一个在预處理后但酶水解前处理所述预处理的木质纤维素原 料 所述步骤例如本领域技术人员所熟知的在酶水解前用水稀释、 用水洗涤、 缓冲、 过濾、 离 心或这些处理的结合。

     然后将所述预处理的木质纤维素原料进行酶水解处理术语 “酶水解” 是指纤维素酶作用于纤维素将其全部戓一部分转变为可溶性糖的过程。 可溶性糖应包括来源于所述 预处理的木质纤维素原料的纤维素部分的水溶性己糖单体和最多 6 个单糖单元嘚低聚糖 可溶性糖的实例包括但不局限于葡萄糖、 纤维二糖、 纤维糊精或它们的混合物。 所述可溶性 糖可以主要是纤维二糖和葡萄糖所述可溶性糖可以主要是葡萄糖。

     所述酶水解过程优选地将约 80％至约 100％或者其间任意范围的纤维素转化为 可溶性糖所述酶水解过程更优選地将约 90％至约 100％或者其间任意范围的纤维素转化 为可溶性糖。在最优选的实施方案中 所述酶水解过程将约 98％至约 100％或者其间任意 范围嘚纤维素转化为可溶性糖。

     使用纤维素酶混合物的酶水解可以是分批水解、 连续水解或其结合所述水解过 程可以是搅动的、 不混合的或其结合。

7.0、 7.5 或其间的任意 pH在水解开始之前所述水解反应器中纤维素的初始浓度优选地为约 4％ (w/w) 至约 15％ (w/w)， 或其间的任意量 例如 4、 6、 8、 10、 12、 14、 15％或其间的任意量。 全部纤维素酶的量可 以是每克纤维素约 0.1 至约 100mg 蛋白质 或其间的任意量， 例如每克纤维素 0.1、 0.5、 1、 5、 10、 15、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100、 120、 140、 160、 180、 200 小时或其间的任意时 长 应理解所述反应条件不意欲以任何方式限制本发明并且可根据本领域技术人员的需要 进行調整。

     所述酶水解一般在水解反应器中进行在将所述预处理木质纤维素原料 ( 也被称 作 “底物” ) 加至所述水解反应器之前、 期间或之后将所述酶混合物加至所述底物中。

     所述修饰纤维素酶优选地在一种或多种深层液体培养发酵中生产 并且可在所述 发酵结束时通过过滤、 离惢或本领域技术人员熟知的其他方法与细胞分离。然后可将所述 无细胞的包含纤维素酶部分进行浓缩 ( 例如通过超滤 )、 防腐并且 / 或者稳定化 然后使用。 或者 不将所述修饰纤维素酶与细胞分离， 而是与所述细胞一起加至酶水解中

     将在以下实施例中进一步描述本发明。但是 应理解这些实施例仅是用于举例描 述的目的， 而不用于以任何方式限制本发明的范围

描述了木质素分离和制备方法。实施例 6 和 7 描述了鼡于鉴定由木质素引 起的失活下降的修饰纤维素酶的高通量筛选测定的方法实施例 8 和 9 涉及由木质素引起 的失活下降的修饰和亲本纤维素酶的表达和鉴定。实施例 10 和 11 描述用于制备和测试包 含在 35、 40、 45、 63、 71、 72、 76、 81 位上的突变的集合体 TrCel6A 变体修饰纤维素酶的方法 具有另外的新连接肽序列的编码修饰 TrCel6A 纤维素酶的数种构建体的设计和制备在实施例 12 中详述， 并且在实施例 13 中描述了这些修饰纤维素酶从酵母中的表达和鉴定实 施例 14 和 15 分别涉及这些修饰纤维素酶从木霉属中的表达及对其的后续分析。 实施例 16 涉及由木质素引起的失活下降的修饰和亲本 TrCel7A 纤维素酶嘚表征

末端引入 NheI 位点。

载体并分离空载体片段将该线性片段和所述最终扩 增子同时转化到酵母菌株 BY4742 中并通过体内重组克隆到其中 (Butler et al.， 2003)

30℃和 300rpm 下培养 16-18 小时至平稳期。对于表达培养物接种 用 25μL 的 预培养物接种含有 1 个玻璃珠的深孔微孔板中的 1ml SC 培养基。在 30℃和 250rpm 下控制 湿度使表达培养物生长 3 天将板在 2800×rpm 下离心 5 分钟以沉淀细胞， 将上清液吸出 用于筛选测定 ( 实施例 6 和 7)对于剩余的预培养物， 通过加入甘油至终浓度 15％淛备原 种 储存在 -80℃。 实施例 5 ： 木质素制备

     使用如美国专利 No.4,461,648 所描述的方法预处理小麦秸秆预处理之后， 加 入浓度为 0.5％的苯甲酸钠作为防腐剂然后使用布氏漏斗和滤纸用 6 倍体积的微温 ( ～ 35℃ ) 自来水洗涤预处理的材料。

4.5将所述固体过滤并用约 8L 水洗涤。在下文中 所述固体将被称为 “木质素” 。

     该实施例描述通过与已经克隆至酿酒酵母中的亲本 TrCel6A 纤维素酶比较来筛 选对由木质素引起的失活具有抗性的修饰 TrCel6A 纤维素酶

上清液。将来自每种变体的另一小份上清液 (0.175mL) 加至相同的微孔板孔中并 在相同的条件下孵育另外 90 分钟将微孔板再次在 2800×g 下离心 3 分钟并迻出 0.175mL

g 纤维素 ) 并且孵育另外 3 个小时。将微孔板在 2800×g 下离心 3 分钟并取出 1 小份上清 液用于检测葡萄糖通过使用常规葡萄糖氧化酶 / 过氧化酶结合反应测定检测葡萄糖来测 量酶活性 (Trinder， 1969)图 2A 示出来自一个筛选板的数据的样本。

纤维素酶的活性比例与具体微孔板上的 6 个亲本 TrCel6A-S413P 对照比较 并使用 t- 检验在 95％的置信度下选出阳性变体 ( 比例增加的变体 )( 图 3)。在微量培养 中再次生产所有阳性变体并且再次筛选以减少假阳性的数量

     该实施例描述通过与亲本 TrCel6A-S413P 纤维素酶比较就木质素抗性来对修饰 TrCel6A 纤维素酶进行筛选。将如实施例 4 所述的一小份 (150μL) 酵母上清液与未经处 理的木质素 (1.6％ w/v) 在 250μL 柠檬酸盐缓冲的 (50mM ； pH 5) 反应系中预孵育将每 种修饰纤维素酶的等份上清液也与经 BSA 预处理的木质素 (1.6％ w/v) 预孵育。预孵育在 50℃和 250rpm 下在含有 1 个箥璃珠的 96 孔微孔板中进行 5.5 小时 (NB Innova 44)在每 个 96 孔微孔板中含有用于比较的 6 个亲本 TrCel6A-S413P 纤维素酶对照。预处理之后 将 微孔板在 2800g 下离心 5 分钟， 吸出上清液用于残余活性测定

的葡萄糖标准曲线样本被放置在 PCR 板的第一栏。孵育之后 将 80μL 的 DNS 加至所有孔中并将板煮沸 10 分钟。将一小份 (150μL) 转移至微孔板孔中然后在 560nm 下检测吸光率通过使用所述葡糖糖标准曲线将 A560 值转变为降低当量 (reducing equivalents) 来确定残余酶活性。图 2B 显示来自一个筛选板的数据的樣本对所有修饰 TrCel6A 纤维素酶和亲本 TrCel6A-S413P 纤维素酶， 通过用未经处理的木质素存在时的残 余酶活性除以经 BSA 处理的木质素存在时的酶活性来计算活性比例将每种修饰 TrCel6A 纤维素酶的活性比例与具体微孔板上的 6 个亲本 TrCel6A-S413P 纤维素酶对照的平均值进 行比较， 使用 t 检验在 95％的置信度下选出阳性变體 ( 比例增加的变体 )在微量培养中 再次生产所有的阳性变体并重新筛选以减少假阳性的数量。

     孵育后 将来自每个培养物的培养液在 9000rpm 下离惢 10 分钟， 丢弃沉淀 ( 包含 酵母细胞 )将所述上清液的 pH 调节至 5.0 然后使其冷却至 4℃ 1 小时。冷却过后 加入 625g(NH4)2SO4 使所述酵母上清液至 93％饱和。在 4℃下持續搅拌使沉淀在 2 小时中发生沉 淀在 9000rpm 下离心 15 分钟后， 丢弃上清液

样本。将每个样本离心以分离木质素并在 4℃储存

     当所述时间进程结束後， 短暂地漩涡震荡每个样本以将所述沉淀重悬浮 并将 50μL 包含可溶和不可溶物质的浆液加至含有 3 个玻璃珠 / 孔的微量滴定板中。向每个孔 加入 20μL 缺少纤维二糖水解酶活性的木霉属纤维素酶稀释制品 (1μg 总蛋白质 ) 并加入 纯化的里氏木霉 Cel3A(1.4μg) 以补充纤维二糖酶水解活性。最后 将 0.2mL 脫木素纤维 素浆液 (0.25％纤维素 ) 加入每个孔中。在 50℃、 250rpm 轨道震荡下将所述测定板孵育 2 小时然后将所述板在 2000×g 下离心 2 分钟， 并且如实施例 6 所述測量葡萄糖浓度

     使用标准曲线将葡萄糖浓度转变为残余纤维二糖水解酶 (CBH) 活性。通过亲本或 修饰 CBH 纤维素酶在 t ＞ 0 小时时的活性除以相应 CBH 纤维素酶在 t ＝ 0 小时时的活性来 计算相对残余 CBH 活性使用方程式 1 将所述相对残余 CBH 活性对时间数据建模。使用微 软表格处理软件 (Microsoft Excel) 中的

t 检验来比较每種修饰纤维素酶与其相应亲本纤维素酶的相对 KL 值小于或等 于 0.05 的 P- 值被认为是统计学显著的。相对 KL 显著高于相应亲本纤维素酶的相对 KL 的 修饰纖维素酶通过了验证 ( 表 5 和图 4)

来产生所述集合体 TrCel6A 变体。将 最终的扩增子使用缺口修复法转化到酿酒酵母菌株 BY4742 中

     从前述实施例发明人鉴定絀了在 TrCel6A 的连接肽序列中的一些突变， 所述突变 赋予了对木质素结合的抗性因此， 发明人构想了以降低由木质素引起的失活的倾向并可 用於其他纤维素酶的方式来改变 TrCel6A 的天然连接肽序列的更广泛的策略

R.A.(2002) 描述的方法将所述纯化的 PCR 产物和线性化的载体 YEp352/P91-1αss( 用 NheI+KpnI 消化的 ) 在 BY4742 酵母菌株中通过体内重组转化并克 隆。 对于每种构建体 均使用从 Hoffman 和 Winston(1987) 改进的方法从所述转化的酵母中 将所述载体分离出来并且转化进入大肠杆菌 DH5α 化學感受态细胞。 使用 Plus SVMinipreps DNA 纯化系统 (Promega) 将质粒从大肠杆菌细胞中分离出来通过 DNA 序列 分析确认所有变体的克隆区域的完整性。

    实施例 13 ： 在 HTS 测定 2 中分析新的连接肽变体如实施例 4 所描述从酿酒酵母中表达所述新的连接肽变体和所述亲本 TrCel6A-S413P 纤维素酶用高通量筛选测定 2( 实施例 7) 测试所有样本的酵母滤出液的 小份。将所述 ±BSA- 木质素比例标准化为所述亲本 TrCel6A-S413P 纤维素酶的 ±BSA- 木 质素比例 并且计算所述新的连接肽变体的 P- 值 ( 图 8 和表 8)。

编码区域进行测序以证实所述连接肽序列中存在突变 使用化学感受态 DH5α 大肠杆菌转化并克隆这些构建体以产生用于转化进入木霉的足够 的 DNA。 将編码所述新 TrCel6A 连接肽变体的载体用于后续的通过如实施例 14.3 所述的原 生质体的 PEG 转化来转化里氏木霉宿主菌株 P297Jaux( 上文描述的 )

凝胶和 PCR 纯化系统纯化夶引物和终产物。

     将合适宿主菌株的 5×106 个孢子铺于补充了 5mM 尿嘧啶的马铃薯葡萄糖琼脂上 将带有菌丝的玻璃 的无菌玻璃纸上 并且于 30℃孵育 20 尛时以促进孢子萌发和菌丝生长。 纸圆片转移至 10mL 的原生质体溶液中 所述原生质体溶液含有包含 0.6M 硫酸铵的 50mM 磷 酸钾缓冲液 (pH 6.5)( 缓冲液 P) 中的 平板在 30℃下培养直到菌落生长可见。将转化株转移至含有 MM 琼脂的各个平板令其形成 孢子收集孢子并以高稀释度铺板于 MM 琼脂上以分离同核体转化株， 然后将所述同核体转 化株铺板于 PDA 以使其生长并使孢子充分形成 以接种下文所述的筛选培养物。

4-5 天的 PDA 板的里氏木霉孢子 来制备孢子悬浮液将约 1×107 个洗涤过的孢子铺在直径为 60mm 的含有缺乏尿嘧啶的 MM 琼脂的平板上。在颗粒送递之后 将所有的转化板在 30℃孵育 5-10 天。将分离的转囮株转 移至第二选择培养基平板上 然后再转移至 PDA 平板上以使其生长并充分形成孢子， 以接 种微量培养物

     将木霉的各个菌落转移至 PDA 板以使每个培养物增殖。孢子形成对于均匀接种微 量培养物是必要的 所述微量培养物被用于检测所述培养物生产纤维素酶的能力。培养基 由鉯下组分组成 ：

     在 24 孔微孔板中以 1mL 培养量在上述培养基中培养各个转化株初始 pH 是 5.5， 在接种前用高压蒸汽灭菌器对所述培养基在 121℃下进行灭菌 30 分钟 对于天然和转化细 4 6 胞， 均从所述 PDA 板上分离出孢子 将其悬浮于水中并使用 10 -10 个孢子 /mL 接种每个培 养物。所述培养物在 30℃的温度下在

PBS(PBS/BSA) 中茬室温下孵育 1 小时用 PBS/ 吐温洗涤封闭的微量滴定孔。在 PBS/BSA 中稀释对 TrCel6A 或 TrCel7A 特异的兔多克隆抗血清 加至不同的微量滴定板中并在室温 下孵育 2 小时。洗涤所述板并将所述板与在 PBS/BSA 中以 1/2000 稀释的与辣根过氧化物 酶 (Sigma#A6154) 偶联的山羊抗兔抗体在室温下孵育 1 小时洗涤之后， 向每个板加入四 甲基联苯胺并在室温下孵育 30 分钟在每个孔中测量 360nm 处的吸光率并使用 TrCel6A 或 TrCel7A 标准曲线将其转化为蛋白质浓度。

表示 为所述组分作为总分泌蛋白质的一部汾的质量百分比 ) 在图 16 中示出

     为进行修饰纤维素酶的纯化和表征， 在 14L 试发酵中培养所选出的表达 TrCel6A 或 TrCel7A 修饰纤维素酶的转化株在 28-30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂上培养里氏木霉菌 株直到获得汇合成片的孢子。收集孢子并用于接种 2L 三角烧瓶中的 750ml 的 Berkeley 培 养基 (10g/l 葡萄糖、 此时以连续方式加入含囿纤 维素酶诱导碳水化合物的碳源 所述碳源来自 35.5％ w/v 的溶于水的固体的储液。使用蠕 动泵以每小时每升培养物 0.4g 碳的加料速度递送所述碳源所述运行的批量和间歇补料 部分期间的运行参数均为 ： 通过 500rpm 的叶轮搅动来混合， 以每分钟 8 标升注入空气 温度 为 28℃。使用与在线 pH 探针连接的自动控制器和能够加入 10％氢氧化铵溶液的泵使培养 pH 在批量生长中保持在 4.0-4.5 在纤维素酶生产过程中保持在 pH 3.5。定期取出 100mL 培养液样本用于生粅量和蛋白质分析

     使用已被称重、 通过玻璃微纤维滤纸真空过滤并且在 100 ℃烘干 4 至 24 小时的 5-10mL 小份来确定所述培养液的生物质含量。根据以下方程式确定生物质浓度

    使用 Bradford 试验确定培养滤出液的蛋白质浓度。利用在 595nm 处的吸光率通 过分光光度计对考马斯亮蓝 G-250 染料的颜色强度变化——其构成该测定的基础——进行 定量使用的标准测定对照是组成和浓度已知的纤维素酶混合物。在 162-170 小时后收集用于酶分析的最终滤出液

通过 SDS- 和 IEF-PAGE 分离每种纯化蛋白质的样 本并通过电泳后考马斯亮蓝染色观察。

变体使用搅拌超滤杯 (Amicon) 和 10kDa NMWL 聚醚砜膜将所 述各种 TrCel7A 变体浓缩并将缓冲液更换为 50mM 柠檬酸钠 (pH 5.0) 中。使用 Bradford 等 (1976) 的方法通过化学方式确定蛋白质的浓度如图 13 所示， 通过 SDS-PAGE 分离每种 纯化 TrCel7A 蛋白质的样本并通过电泳后考马斯亮藍染色可视化