CST的一抗只标明IF-IC的能用来做组织的免疫荧光吗

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免疫荧光一抗二抗的选择及其技巧
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免疫荧光单标记和双标记的方法
免疫荧光单标记和双标记的方法
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免疫荧光单标记和双标记的方法
l免疫荧光单标记方法
荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。
1)所需材料与试剂
(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。
(2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。
(4)封闭液。
(5)0．01mol／LPBS缓冲液。
2)染色方法
(1)取出培养有细胞的盖玻片或glass―bottom培养皿，用0．01MPBS洗2―3遍。
(2)加入0．3％的TritonX―100，37℃，30rain。
(3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
(4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃过夜。抗体以0．01mol／LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。
(6)0．3％TritonX―100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。
(7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗，37℃，孵育1h。
(8)0．3％TritonX―100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用滤纸吸干。
(9)90％甘油(PBS配制)封片。
(10)激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。
2．免疫荧光双标记方法
免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。其次，两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠，且尽量远离，通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等来组合。通常情况下，染色时两种一抗可以同时孵育，然后可以同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱，而另一种颜色比较强时，应考虑先孵育颜色较弱的二抗。其他步骤同免疫荧光单标记。
3．样品制备注意事项
(1)在进行免疫荧光标记时，如样品的来源为组织，应采用冷冻切片。
(2)样品制备应满足一般荧光显微镜观察的要求。
(3)尽量去除非特异性荧光信号。细胞经荧光染色后可能会产生自发荧光，可用PBS取代一抗作为对照，以区分自发荧光和阳性结果。
(4)为了不将细胞压扁，盖玻片与载玻片之间的介质多用甘油与PBS混合液(9：1)封片，甘油还有抗荧光淬灭的作用。同时还应注意封片时避免产生气泡。
(5)用指甲油将盖玻片四周封片，注意避免将细胞压扁。
(6)为防止荧光淬灭，可在介质中加入抗氧化剂DABCO(100mg／mi)，室温，密封可保存6个月；或苯二胺(100mg／mi)，-20℃，保存2～3周。
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【免疫染色技术】IHC, ICC & IF的区分
来源:生物谷
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&&& 免疫组织化学、免疫细胞化学和免疫荧光是生物学中经常用到的三种应用，他们的英文名分别是Immunohistochemistry (IHC)，Immunocytochemistry (ICC) 和Immunofluorescence (IF)。对于实验室新手来说可能是很容易搞混的，即便是技术大拿们可能在写英文文献的时候也会不小心用错，因为这三个应用确实有些相似，那么下面就随小编一起来看一下他们到底区别在哪里吧。
词根意义：
Immuno-指的是免疫技术 （例如，抗体和抗原的结合）
Histo-指的是组织（细胞以及它周围的细胞外基质）
Cyto-指的是细胞（不包含细胞外的基质）
Chemistry-在这里指的是化学检测方法（例如，颜色的变化）
Fluorescence-对被激发的荧光团的检测
&&&&& 对于这三个应用，有一个部分大家肯定不会搞混的就是&免疫-&，因为这三个应用都涉及到使用抗体，问题出在当你使用荧光剂来标记一抗或者使用荧光标记二抗的时候。IHC和ICC应用用中文来看很好区分，一个应用的样本类型是组织（IHC），另一个样本类型是细胞（ICC），可是一旦使用了荧光标记，大家似乎就有点不知道该用哪个了，因为免疫荧光指的就是使用了荧光标记，这时就很容易只写一个IF，而不去写明到底是组织（IHC）还是细胞（ICC）。这也是为什么小编个人不太喜欢用免疫荧光（IF）来作为一个应用命名的原因，因为免疫荧光不能提供给你足够的信息，只是告诉读者你用了荧光剂，可是这个一抗到底是用在组织上的还是细胞上的呢？所以小编认为，应用了荧光剂的IHC和ICC应该更名为IHF和ICF分别意为Immunohistofluorescence（免疫组织荧光）和Immunocytofluorescence（免疫细胞荧光），虽然这两个词汇在英文文献中应用的还不是很广泛，但绝对不是小编自己杜撰的哦，已经有些学者在使用了，规范化应该也只是时间的问题，现在来看几幅图片更好的区分他们吧！
先不看答案，你能看出这些分别是什么应用吗？
A. IHC (免疫组织化学) 使用小鼠抗HCN1单克隆抗体 (SMC-304) 对小鼠小脑的免疫组化分析. 固定: 室温下10% 福尔马林溶液处理 12-24小时. 一抗: 小鼠抗HCN1单克隆抗体, 1:1000, 室温下孵育1小时. 二抗: HRP/DAB 检测系统:生物素偶联的山羊抗小鼠, 链霉亲和素过氧化物酶, DAB 色原 (棕色), 室温下孵育30分钟. 复染色: Mayer氏苏木素 (紫色/蓝色) 细胞核染色, 250-500uL, 室温下5分钟.
B. ICC（免疫细胞化学）使用小鼠抗Hsp70单克隆抗体 (SMC-100) 对小鼠热休克的黑素瘤细胞的免疫细胞化学分析. 固定: 福尔马林. 一抗: 小鼠抗Hsp70单克隆抗体, 1:1000, 室温下隔夜孵育. 二抗: Biotin 山羊抗小鼠. 图片来自: Dr. Ewa Malusecka, Maria Sklodowska-Curie Memorial Cancer Ceter and Inst. Of Oncology, Poland.
C. IHF (免疫组织荧光) 使用小鼠抗Neuroligin 4单克隆抗体 (SMC-469) 对小鼠齿状回的免疫组织荧光分析. 固定: 甲醛固定石蜡包埋. 一抗: 小鼠抗Neuroligin 4单克隆抗体, 1:100. 二抗: FITC 山羊抗小鼠 (绿色). 复染色: DAPI (蓝色) 细胞核染色, 1:1000. 图片来自:
Rachel Reith, NIH/NIMH.
D. ICF (免疫细胞荧光)
使用小鼠抗HO-1单克隆抗体 (SMC-131) 对人HeLa Cells的免疫细胞荧光分析. 固定: 室温下2% 甲醛处理20分钟. 一抗: 小鼠抗HO-1单克隆抗体, 1:100, 4℃下孵育12小时. 二抗: FITC 山羊抗小鼠 (绿色), 1:200, 室温下孵育2小时. 复染色: DAPI (蓝色) 细胞核染色, 1:40000, 室温下2小时. 染色定位: 微粒体. 内质网. 低氧时定位至细胞核. 放大倍数: 100x.
做完这个小测试之后是不是对这几个应用的区别有了更直观的了解了呢？小编再来给大家总结一下：
A图和B图是免疫化学（Immunochemistry），这种应用是用抗体检测目标蛋白然后利用化学反应来产生颜色变化。根据样本类型的不同，又分为免疫组织化学（A图）和免疫细胞化学（B图）。
C图和D图很明显的就是免疫荧光（Immunofluorescence），这种应用是用抗体检测目标蛋白然后通过偶联的荧光团来显色。同样根据样本类型的不同，又可分为免疫组织荧光（C图）和免疫细胞荧光（D图）。
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