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【求助】Percoll密度梯度离心
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我取人流产后的绒毛组织,称湿重为2.85g,剪碎后用0.25%胰酶消化并经200目不锈钢筛网过滤,得到不少细胞沉淀,估计至少有5*108个,于是进行Percoll密度梯度离心。用45%和25%两个密度梯度，离心2500转*20分钟，见极少的云雾状中层，细胞板计数只有1-1.5*106/ml,这种情况已经发生两次了,不知什么原因,请教各位大虾,如何提高细胞得率,因为我后面还要做细胞磁分选,细胞太少是不行的。十分感谢！！！
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你用200目滤网过滤后，低温离心机500rpm离心8 min，沉淀你要得细胞(用作细胞培养)，上清液再以×100g离心10 min，进一步除去你不想要得细胞，得到的细胞悬液，以×400 g离心10 min，得到的细胞沉淀，用PBS 洗涤，再×400 g 离心10 min，PBS重悬，进行50% Percoll，25% Percoll密度梯度离心，调整细胞浓度为1×107/L，100 mL/L小牛血清RPMI 640培养。另外，细胞得率与离心时的温度有关，最好是在20度左右，这是细胞得率最高。这是一种连续密度梯度离心分离法，Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。用Percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后，使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速但操作流程较长，手续较多，所以我认为你非用这种方法不可才用它，否则，你选择其他的方法较简单。不知你明白了没有，祝你好运。
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可以注意三个问题：
1、能否选用胶原酶来替代胰酶，胰酶消化条件不易控制，对细胞极易过度消化，导致细胞活性不好，在后继的分离过程中死亡。
2、在密度梯度分离时，等分细胞不能太浓，可用多个10ml离心管来分离，提高分离的效率。
3、在吸取分离细胞时，如不太熟练，可以小心先把上面一层Percoll吸取后，再吸细胞层。
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关于丁香园C57BL/6J小鼠肝脏不同细胞类群的分选及肝细胞蛋白质表达谱构建--《西北农林科技大学》2011年硕士论文
C57BL/6J小鼠肝脏不同细胞类群的分选及肝细胞蛋白质表达谱构建
【摘要】：肝脏是哺乳动物体内最重要和最复杂的器官之一,承担着体内的物质代谢,血浆蛋白的合成,储存维生素和糖原,解毒和胚胎发育阶段的造血功能,和免疫防御应答等功能。人类肝脏蛋白质组计划实施以来,在组织水平和亚细胞水平对人和小鼠的肝脏已经进行了大量蛋白质组学方面的研究,取得了很多具有重要意义的研究成果,积累了大量的高可信度的肝脏蛋白质表达谱数据。随着研究的进一步深入,许多诸如肝脏不同细胞类群的蛋白质组成和修饰方式,肝脏组织和亚细胞来源的蛋白质分子的细胞定位,肝脏不同类型细胞基本生命活动的动态蛋白质组变化,以及肝脏疾病的发生机制等基本的科学问题都亟待细胞水平的肝脏蛋白质组学研究来解决。开展肝脏不同细胞类群的蛋白质组学研究,已经成为肝脏蛋白质组学研究的新趋势和重要内容。构建肝脏不同细胞类群蛋白质表达谱的研究工作是解决以上这些科学问题的基础。
获得足够纯度和数量的肝脏原代细胞是构建肝脏不同细胞类群蛋白质表达谱研究的基础。本研究通过改良Seglen大鼠肝细胞分离法,建立了小鼠肝脏细胞分离的原位循环两步灌流法。采用该方法对C57小鼠肝脏进行原位循环灌流,离体消化肝脏组织,差速离心获得纯化的小鼠肝细胞,显微形态观察、伊红苏木精、糖原检测及免疫细胞化学等检测方法鉴定所获得的肝细胞纯度,胎盘蓝拒染实验检测细胞活性,并对原代分选的肝细胞进行培养。每只C57小鼠肝脏可分选到活性90%以上的、纯度95%以上的4.2～6.5×107的小鼠肝细胞,该原代肝细胞可持续培养7天以上,且细胞状况良好。分选所得到的小鼠肝细胞完全满足构建肝细胞蛋白质组表达谱构建实验的需要。
肝脏非实质细胞种类多样,功能复杂,与肝脏发育及肝脏疾病密切相关。分离纯化肝脏主要非实质细胞类群的研究工作由来已久,主要集中在针对大鼠和人的肝脏非实质细胞的分选。为了开展肝脏主要非实质细胞类群的蛋白质组学研究,本研究采用改进的Seglen胶原酶两步原位灌流法对小鼠肝脏进行灌流,离体消化肝脏组织,获得C57小鼠肝脏的非实质细胞群体后,综合利用Nycodenz?、PercollTM、OptiPrepTM等不同类型的密度梯度介质进行密度梯度离心分离纯化了C57小鼠的肝脏星形细胞、肝脏内皮细胞和肝脏枯否细胞类群,流式细胞术检测细胞纯度,胎盘蓝拒染检测细胞活性和常规血球计数法计算细胞,综合评价三种不同密度梯度介质分选肝脏主要非实质细胞的优缺点。结果发现,Nycodenz在分离纯化肝脏星形细胞时具有明显优势,OptiPrepTM对于肝脏主要非实质细胞类群的分选均具有较高的细胞纯度,细胞活性和细胞得率,可作为肝脏非实质细胞分选的可靠方法之一。采用Moflo高速流式细胞分选仪分选肝脏主要非实质细胞类群,与密度梯度离心法和免疫磁珠法相比较,高速流式细胞术所分选的肝脏内皮细胞和枯否细胞具有最高的细胞纯度、细胞得率和细胞活性。利用该方法成功分选到完成肝脏内皮细胞和枯否细胞蛋白质表达谱构建的细胞。
建立适合微量复杂生物蛋白质样品分离鉴定的技术体系,是完成肝脏不同细胞类群蛋白质表达谱实验的技术基础。本研究在Eksigent的全二维微量液相色谱系统上,建立了适合肝脏细胞蛋白质组学研究的Shotgun策略。该体系蛋白上样量仅为30μg,流动相A(柠檬酸-氨水)在pH 3.0～8.5和3.5 mM～46.5 mM范围内可形成10个梯度,流动相B(NH4Cl)在2 mM～2000 mM,2% CAN+0.1% FA范围内可形成9个梯度。分别结合LTQ-MS/MS和LTQ-FT-MS/MS系统(Thermo FinniganTM公司)进行鉴定,质谱分析以一个全扫描(Full MS:400-2000,全扫描160min, MS/MS采集数据140min)及三个分段扫描(Mass Range: m/z 400-650/600-800/800-2000,MS/MS采集数据140min)模式进行;反转数据库评价,确定95%可信度、双肽段匹配(95P2)的数据标准。综合采用SDS-PAGE结合nano-LC-LTQ-FT-MS/MS蛋白鉴定,与Shotgun策略相同的质谱数据采集模式和数据标准,获得C57小鼠肝细胞蛋白质表达谱数据。
C57小鼠肝细胞蛋白质表达谱数据中包括,95%可信度的双肽段蛋白质分子3703个,40个肝细胞CYP分子,223个新的肝脏蛋白质分子。比较分析C57小鼠肝细胞蛋白质表达谱数据后发现,肝细胞合成并分泌的血浆蛋白质分子有724个,肝脏组织间隙液蛋白质分子有21个,在小鼠胎肝组织和成年小鼠肝脏中均表达的215个。与亚细胞蛋白质表达谱数据比较分析后分析,肝细胞蛋白质表达谱中2239个蛋白质分子具有明确亚细胞定位。其中包括:250个定位于细胞胞浆,37个定位于高尔基体,734个定位于微粒体,209个定位于线粒体,138个定位于细胞质膜,191个定位于内吞体,35个定位于蛋白水解酶体,645个蛋白质分子定位于内质网.
综上所述,本研究首次成功构建了适合小鼠肝脏细胞分离的原位循环灌流法,结合差速离心法分离纯化了构建肝细胞蛋白质表达谱实验的肝细胞,利用Moflo高速流式细胞分选仪分选了构建肝脏内皮细胞和枯否细胞表达谱的细胞,建立了适合肝脏细胞蛋白质组学研究所需的蛋白分离和鉴定体系,首次成功构建C57小鼠肝细胞蛋白质表达谱数据,获得了3703个高可信度的肝细胞蛋白,其中包含鉴定最多的40个细胞色素P450分子,223个新蛋白,结合肝脏组织和亚细胞蛋白质组学方面的数据比较分析,获得了肝脏在发育阶段,血浆、组织间隙液、和亚细胞定位等方面的相关信息。提供了肝脏其它细胞类型的蛋白质组学研究的实验技术体系,可供其它肝脏科学问题研究参考的高质量肝细胞蛋白质表达谱数据。
【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：Q813【目录】：
摘要5-7ABSTRACT7-13第一章 文献综述：小鼠肝脏蛋白质组学的研究进展13-40 1.1 引言13-16 1.2 小鼠肝脏组织水平的蛋白质组学研究16-19
1.2.1 小鼠肝脏组织的蛋白质组学研究16-18
1.2.2 小鼠肝脏组织间隙液的蛋白质组学研究18-19 1.3 小鼠肝脏亚细胞水平的蛋白质组学研究19-26
1.3.1 小鼠肝脏线粒体蛋白质组学研究20-22
1.3.2 小鼠肝脏内质网蛋白质组学研究22
1.3.3 小鼠肝脏细胞质膜蛋白质组学研究22-24
1.3.4 小鼠肝脏过氧化物酶体蛋白质组学研究24-25
1.3.5 小鼠肝脏微粒体蛋白质组学研究25
1.3.6 小鼠肝脏中蛋白复合体的蛋白质组学研究25-26 1.4 小鼠肝脏细胞水平的蛋白质组学研究26-27
1.4.1 小鼠肝脏实质细胞蛋白质组学研究26-27
1.4.2 小鼠肝脏干细胞/祖细胞蛋白质组学研究27 1.5 疾病模型小鼠肝脏的蛋白质组学研究27-35
1.5.1 肥胖小鼠肝脏蛋白质组学研究27-28
1.5.2 脂肪肝小鼠蛋白质组学研究28-29
1.5.3 肝炎病毒感染小鼠肝脏蛋白质组学研究29-30
1.5.4 衰老小鼠肝脏蛋白质组学研究30-32
1.5.5 药物/毒素对小鼠肝脏影响蛋白质组研究32-34
1.5.6 转基因小鼠模型的蛋白质组研究34-35 1.6 小鼠肝脏蛋白质修饰谱和相互作用组研究35-39
1.6.1 肝脏磷酸化蛋白质组学研究35-37
1.6.2 肝脏糖蛋白质组学研究37-38
1.6.3 肝脏蛋白相互作用组学研究38-39 1.7 结语39 1.8 本研究的目的和意义39-40第二章 小鼠肝脏原位灌流法建立及肝细胞分选40-49 2.1 材料与方法41-43
2.1.1 材料41-42
2.1.2 方法42-43 2.2 结果与分析43-45
2.2.1 小鼠肝脏在体原位循环灌流体系的建立43
2.2.2 小鼠肝细胞的得率及存活率43-44
2.2.3 小鼠肝细胞的形态观察44
2.2.4 小鼠肝细胞的纯度检测结果44-45 2.3 讨论45-48 2.4 小结48-49第三章 肝脏非实质细胞分选方法的初步建立49-62 3.1 材料与方法50-51
3.1.1 材料50-51 3.2 方法51-54
3.2.1 小鼠肝细胞分离纯化51-52
3.2.2 Nycodenz?密度梯度细胞分离液分选小鼠肝脏非实质细胞52
3.2.3 PercollTM 淋巴细胞分离液分选肝脏非实质细胞52
3.2.4 OptiPrepTM 细胞密度梯度分离液分选肝脏非实质细胞52
3.2.5 流式细胞术检测肝脏非实质细胞纯度52-53
3.2.6 免疫磁珠法分离肝脏血窦内皮细胞53
3.2.7 Moflo 高速流式细胞分选仪分选肝脏非实质细胞53
3.2.8 肝脏非实质细胞活性检测与得率计算53-54
3.2.9 细胞冻存54 3.3 结果与分析54-60
3.3.1 密度梯度法纯化小鼠肝脏非实质细胞的纯度54-57
3.3.2 免疫磁珠法分选小鼠肝脏血窦内皮细胞57
3.3.3 Moflo 高速流式细胞分选仪分选的肝脏非实质细胞57-59
3.3.4 比较不同细胞分选方法所得细胞的活性和细胞得率59-60 3.4 讨论60-61 3.5 小结61-62第四章 C57BL/6J 小鼠肝细胞蛋白质表达谱的构建与分析62-92 4.1 材料63-65
4.1.1 实验动物63
4.1.2 试剂63
4.1.3 常规溶液配制63-64
4.1.4 仪器64-65 4.2 方法65-69
4.2.1 总体技术路线65
4.2.2 C57 小鼠肝细胞的提取65
4.2.3 C57 小鼠肝细胞蛋白质样品制备65-66
4.2.4 C57 小鼠肝细胞蛋白SDS-PAGE 分离66
4.2.5 SDS-PAGE 分离的肝细胞蛋白质胶内酶切肽段提取及质谱鉴定66-67
4.2.6 C57 小鼠肝细胞全蛋白质溶液酶切及其质谱鉴定67-68
4.2.7 质谱数据的搜库和数据过滤标准的确定68
4.2.8 小鼠肝细胞表达谱数据的生物信息学分析68-69 4.3 结果与分析69-88
4.3.1 不同技术路线鉴定小鼠肝细胞蛋白质的结果69
4.3.2.不同技术路线所鉴定蛋白质和特异肽段的重叠度分析69-71
4.3.3 不同技术路线所鉴定蛋白的理化性质71-72
4.3.4 代谢类蛋白质分子的鉴定72-78
4.3.5 小鼠肝细胞中鉴定到的新蛋白78-80
4.3.6 小鼠肝细胞蛋白质表达谱中所鉴定的 CYP80-84
4.3.7 小鼠肝细胞与肝脏组织水平的蛋白质表达谱数据的比较分析84-86
4.3.8 C57 小鼠肝细胞蛋白质的亚细胞定位比较分析86-88 4.4 讨论88-91 4.5 小结91-92结论92-93参考文献93-107附录1107-115附录2115-202英文缩写词对照表202-203致谢203-204作者简历204
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京公网安备75号水生生物学报
水生生物学报
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水生生物学报
2013年&37卷&5期
王梅芳, 宾承勇, 豆伟, 余祥勇
贝类精子质量检测与评价方法研究Ⅰ：染色法检测马氏珠母贝精子的存活率的研究
用曙红Y、台盼蓝染料对马氏珠母贝(Pinctada martensii)精子进行染色, 通过对不同制片方法、不同的染色时间和不同染料浓度的染色效果进行比较, 筛选出可通过染色特征来检测精子死活及活精率的适宜方法, 结果显示: (1) 经染色后, 死、活精子呈现出明显不同的特征: 活精子均不着色, 头部呈梨形、无色透明状; 死精子着红色(曙红Y染色)或蓝色(台盼蓝染色), 体积变大, 头部近圆形。(2) 曙红Y、台盼蓝最适染色浓度分别为0.04%和0.2%; 最佳染色时间均为15min。(3) 检测到的精子死亡率即实测精子死亡率, 与“理论死亡率”之间有明显的相关性, 相关系数为R=0.99 (P<0.01), 并且两种染色法的观察结果一致, 表明这些检测结果客观可信; (4) 染料对活精子毒性的检测显示, 染色45min内, 精子死亡率无显著性增加(P>0.05), 说明在该时间范围内, 染液对精子的毒性较小, 精子存活率的检测结果稳定可靠。这些研究表明, 曙红Y、台盼蓝两种染色法准确灵敏, 均适宜用于马氏珠母贝精子质量的检测与评价。
2013&Vol. 37&(5):&803-809
陈生熬, 马春晖, 丁慧萍, 周贤君, 谢从新
塔里木河叶尔羌高原鳅繁殖生物学研究
2010年7月至2011年12月, 在塔里木河阿拉尔段采集叶尔羌高原鳅Triplophysa (Hedinichthys) yarkandensis (Day) 940尾(除性别未辨个体外)用于繁殖生物学研究。种群雌雄比为0.85:1, 最小性成熟, 雌性个体体长为8.2 cm, 体重为7.4 g, 年龄为3龄; 雄性个体体长为6.5 cm, 体重为3.4 g, 年龄为2龄。叶尔羌高原鳅卵径分布呈单峰形, 推测应属于同步产卵类型。计算了88尾Ⅳ-Ⅴ期雌鱼的怀卵量, 其体长范围30-195 mm, 体重范围3.59-114.04 g, 绝对繁殖力为 (87)粒, 相对繁殖力为824-±158); 塔里木河阿拉尔段叶尔羌高原鳅种群繁殖力(Fp)为403.46万粒。
2013&Vol. 37&(5):&810-816
王芳, 李凯彬, 聂湘平, 刘春, 劳海华, 王英英, 梁慧丽, 吴淑勤
剑尾鱼P-糖蛋白基因全长cDNA克隆、分析及组织分布
P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)为ABC转运体超家族的主要成员, 分布于细胞膜, 依赖ATP供能, 可将细胞内的亲脂性毒物或药物逆浓度泵出胞外, 在机体解毒上具重要功能。研究采用RT-PCR和RACE法对剑尾鱼P-gp基因进行克隆并获得了全长cDNA序列4301 bp, 该基因编码1286个氨基酸残基, 估算编码蛋白的分子质量为141.64 kD。生物信息学分析表明, 剑尾鱼P-gp不含信号肽序列, 具ATP转运家族蛋白的典型结构域, 包括2个疏水性的跨膜区(Transmembrane domains, TMD) 和2个位于细胞浆内的核苷酸结合区(Nucleotide-binding domains, NBD), 为全转运子, 每个跨膜区都有6个跨膜α螺旋, 而每个NBD包含1个ABC转运体家族标记序列; 跨膜性质预测结果显示该蛋白属膜蛋白, 具P-gp的典型特征。序列同源性分析发现, 不同进化地位动物P-gp存在高度同源性, 显示P-gp在系统进化上高度保守。P-gp在剑尾鱼肝脏、肾脏、脑等不同组织均有表达, 其中以肝脏的相对表达量最高, 是P-gp检测的代表组织。QRT-PCR实验表明, 苯并(a)芘胁迫可明显诱导P-gp mRNA的表达。剑尾鱼P-gp的表达水平或可作为一个生物标记物指标, 应用于环境持久性有机污染物的监测研究中。
2013&Vol. 37&(5):&817-823
张涵, 周涛, 王岩
综合养殖池塘中三角帆蚌和鱼类肠道细菌的组成
采用PCR-DGGE (PCR-denaturing gradient gel electrophoresis)方法研究了综合养殖池塘中三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鳊(Parabramis pekinensis)、银鲫(Carassius auratus gibelio)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)和鳙(Aristichthys nobilis)的肠道细菌组成, 并分析了水体中的浮游细菌对鱼、蚌肠道细菌的影响。研究结果表明, 三角帆蚌和混养鱼类肠道细菌属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、蓝细菌(Cyanobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)。其中, 三角帆蚌肠道优势菌群为不动杆菌属(Acinetobacter)、志贺氏菌属(Shigella)和分枝杆菌属(Mycobacterium), 草鱼肠道优势菌群为梭菌属(Clostridium), 鳊肠道优势菌群为梭菌属和假单胞菌属(Pseudomonas), 银鲫肠道优势菌群为不动杆菌属和志贺氏菌属, 青鱼肠道优势菌群为梭菌属和不动杆菌属, 鳙肠道优势菌群为不动杆菌属和弧菌属(Vibrio)。三角帆蚌与银鲫肠道细菌谱带相似性较高, 草鱼与鳊肠道细菌谱带相似性较高, 表明鱼类肠道细菌组成特点与食性存在一定的关系。水体浮游细菌优势菌群为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。三角帆蚌及鱼类肠道细菌群落与水体浮游细菌群落组成相似性较低, 表明水体浮游细菌对三角帆蚌和鱼类肠道细菌优势菌群的影响有限。
2013&Vol. 37&(5):&824-835
董静, 李艳晖, 李根保, 李耀迪, 刘永定, 宋立荣
东江水系浮游植物功能群季节动态特征及影响因子
2009年12月至2010年9月对东江水系进行了枯水期、平水期、丰水期的三次浮游藻类采集, 以分析浮游藻类功能群组成、季节变化特征及影响其季节变化的物理因子。结果表明, 东江水系浮游藻类在样品中出现频率大于10%的物种归入14个功能群, 分别是J、X2、P、W2、H1、MP、D、F、C、LO、W1、N、X1和 M。其中优势功能群是J、X2、P、W2、H1、MP、D、F、C、LO和 M。浮游藻类功能群组成明显随季节变化, 枯水期时功能群MP、D、P、X2、F、J和W2占优势; 丰水期时, 功能群MP、J、H1、LO占优势。除功能群理论中提到的营养(碳氮硅)、光照强度和生物作用(滤食)外, 水体物理因子——溶氧、水温、pH、TDS也是影响浮游藻类功能群季节动态的重要环境因子。研究表明温带湖泊调查提出的浮游藻类功能群概念用于河流生态系统浮游植物的研究是合适的。
2013&Vol. 37&(5):&836-843
黄钧, 黄艳华, 胡大胜, 罗华平, 施金谷, 彭民毅, 禤均成, 覃丽芬, 滕忠作, 曾桂忠
黄沙鳖白底板病病原菌的分离鉴定及6种毒力基因检测
用常规方法从患典型白底板病黄沙鳖的心脏、肝脏等处进行细菌的接种分离, 通过人工感染确定分离菌株的致病性, API 20NE、16S rRNA基因序列分析进行病原菌鉴定和确定其系统发育地位, K-B纸片扩散法进行药敏试验, PCR检测病原菌的6种毒力基因。试验结果, 共分离到13株病原菌, 其中嗜水气单胞菌9株, 温和气单胞菌4株。在9株嗜水气单胞菌中, 有5株与Aeromonas hydrophila ATCC 7966菌株亲源关系最近, 4株与Aeromonas hydrophila北京株QDC01的亲源关系最近; 而4株温和气单胞菌与Aeromonas sobria ATCC 43979的亲源关系最近。药敏试验结果, 仅头孢哌酮对13株病原菌都高度敏感, 来源于不同养殖区域的病原菌药敏结果相差较大。6种毒力基因的阳性率, Aer、Act和ahp均为100%, hly和Alt为92.31%, ahal为76.92%; 毒力基因型共有4种, 嗜水气单胞菌主要为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+基因型, 而温和气单胞菌主要为 hly+Aer+Alt－Act+ahal+ahp+基因型, 同时携带hly基因的菌株其致病力更强。
2013&Vol. 37&(5):&844-854
卢占晖, 薛利建, 张龙, 徐开达, 张亚洲
东海大陆架虾类资源量评估
根据2008年春(5月)、夏(8月)、秋(11月)、冬(2009年2月)四季东海区桁杆拖虾网调查资料, 应用资源密度法首次估算了调查海域主要经济虾类和总体的现存资源量和最大持续产量(MSY)。结果表明: 调查海域虾类季度平均资源密度为203.5 kg/km2。根据季节分布, 以夏季最高, 冬季最低; 根据区域分布, 南部海域最高, 中部最低。调查海域虾类的现存资源量约为10.6×104 t, MSY约为22.2×104 t, 与2008年调查海域虾类渔获量比较, 表明该海域虾类资源总体利用略显不足, 尚有一定潜力。在主要经济虾类的现存资源量与MSY中, 以假长缝拟对虾Parapenaeus fissuroides最高; 与历史资料相比, 某些经济价值较高的种类, 如哈氏仿对虾Parapenaeopsis hardwickii、日本对虾Penaeus japonicus等的资源量明显减少, 而长角赤虾Metapenaeopsis longirostris等经济虾类较低的种类资源量有所上升, 这说明东海大陆架海域虾类资源组成情况已经发生了很大改变。
2013&Vol. 37&(5):&855-862
陈松波, 龚丽, 范兆廷, 刘海金
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牙鲆MyoD基因单核苷酸多态性位点的筛选
运用PCR-SSCP技术研究100尾牙鲆(Paralichthys olivaceus)MyoD基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs), 并将筛选到的突变位点与牙鲆生长性状进行相关性分析。结果表明, 在外显子1和内含子1上存在3个SNPs, 在外显子1 (MyoD2)基因座发现3种基因型AA、AB和BB, G863A突变, 属于同义突变。在内含子MyoD4基因座检测到DD、FF、CD、CE、DE和DF型个体。利用最小二乘法研究MyoD基因多态性位点对牙鲆生长性状的影响。结果表明, 外显子1的SNPs对生长性状无显著影响(P&0.05)。内含子1的SNPs对牙鲆的生长性状影响均显著(P&0.05)。研究结果为SNPs位点与牙鲆生长性能关联分析奠定了基础。
2013&Vol. 37&(5):&863-868
邓道贵, 杨威, 孟小丽, 葛茜, 金显文, 胡振东
淮河中游浮游甲壳动物群落结构的季节动态
月对淮河中游浮游甲壳动物群落结构的季节动态进行研究。共记录浮游甲壳动物24种, 其中枝角类8属13种、桡足类9属11种。枝角类在4月和9月形成两个峰值, 即(28.2±21.6) ind/L和(40.8±10.1) ind/L, 其优势种分别为僧帽溞 Daphnia cucullata和脆弱象鼻溞 Bosmina fatalis。捕食性桡足类-近邻剑水蚤Cyclops vicinus vicinus、广布中剑水蚤Mesocyclops leuckarti和台湾温剑水蚤Thermocyclops taihokuensis分别在4月、5月和6月形成较大的密度。汤匙华哲水蚤Sinocalanus dorrii和中华窄腹剑水蚤Limnoithona sinensis分别在5月和8月占优势。小型浮游植物(≤20 μm)生物量在4月达到最大值, 之后快速下降, 而较大型浮游植物(>20 μm)生物量从4月上升, 到7月达到最大值。典型冗余分析(RDA)显示, 溞属Daphnia的仲春下降与捕食性桡足类(尤其是近邻剑水蚤)的摄食压力、浮游植物生物量的季节变化密切相关。
2013&Vol. 37&(5):&869-875
董桂芳, 杨严鸥, 陈路, 李辉, 阎博, 罗平远, 苏波
斑点叉尾(鱼回)和杂交鲟幼鱼昼夜摄食节律和胃肠排空时间的研究
采用一次饱食投喂(将一昼夜分为8个时间段, 每个时间段作为一个处理组, 每天每个处理组饱食投喂一次)和分段式连续投喂(将一昼夜分为8个时间段, 每天每个实验缸连续投喂8次)两种方法研究斑点叉尾(鱼回)和杂交鲟幼鱼的昼夜摄食节律, 同时研究它们在摄食后24h内胃和全肠的排空时间。结果显示, 在两种投喂方式下, 斑点叉尾 均表现出24h一周期的摄食节律, 两个日摄食率高峰值均出现在06:00和18:00 (P&0.05)。杂交鲟在一次饱食投喂下表现出24h一周期的摄食节律, 高峰值分别出现在11:00、17:00和05:00, 在分段式连续投喂时表现出48h一周期的摄食节律, 高峰值分别出现在11:00、17: 00和36:00。在摄食后1-9h内, 斑点叉尾 的胃内含物比率急剧降低(P&0.05), 并在24h时出现极低值(P&0.05), 而1-9h内全肠内含物比率迅速升高(P&0.05), 在9h时达到最大(P&0.05), 在24h出现极低值(P&0.05)。在摄食后1-7h内, 杂交鲟的胃内含物比率迅速下降(P&0.05), 在24h时出现极低值(P&0.05), 1-7h内肠内含物比率迅速升高(P&0.05), 24h时呈现极低值(P&0.05)。结果表明, 两种实验鱼表现出不同的昼夜摄食节律, 该节律受各自胃肠排空时间的影响, 也受投喂时间的影响。研究建议, 在斑点叉尾(鱼回)和杂交鲟幼鱼的养殖中宜在光线较弱的清晨(05:00-06:00)和黄昏(17:00-18:00)进行投喂。
2013&Vol. 37&(5):&876-884
李庆飞, 艾庆辉, 麦康森, 郑岳夫, 徐玮, 张文兵
大黄鱼头肾巨噬细胞体外模型的构建
通过优化Percoll密度梯度离心技术,从大黄鱼 (Larmichthys crocea) 头肾组织中分离纯化巨噬细胞,并优化细胞培养条件。对所分离细胞进行形态学分析、普通光镜和电镜超微结构观察以及细胞功能验证实验。实验结果表明：细胞单层置于22℃无CO2恒温培养箱中,于L15培养基中培养5d后仍保持较高的活力。普通光镜和电镜观察到大黄鱼头肾巨噬细胞具有伪足发生和较强的吞噬能力、胞浆中富含线粒体以及吞噬小泡。巨噬细胞与不同浓度(0、0.1、1、20 μg/mL)的脂多糖(LPS,Escherichia coli 055:B5)分别孵育3h和24h。施加LPS刺激后,细胞呼吸暴发活性随LPS浓度以及孵育时间变化而变化。孵育3h后,0.1 μg/mL LPS协同PMA可显著诱导巨噬细胞活性氧中间体(ROI)的产生。孵育24h后,所有处理组LPS协同PMA显著抑制细胞ROI的生成(P &0.05)。未添加PMA时, 经1 μg/mL LPS孵育3h和24h后的巨噬细胞细胞ROI的生成量显著降低(P &0.05), 其他LPS处理组间细胞ROI的生成量无显著差异。
2013&Vol. 37&(5):&885-891
马军国, 李效宇
白鲢肝脏CYP3A序列分析及毒死蜱对其抑制作用研究
CYP3A是I相解毒酶系CYP450家族中的重要成员,在肝脏解毒过程中发挥重要作用。首次克隆了白鲢肝脏CYP3A基因并研究了毒死蜱对该基因表达的影响。生物信息学分析预测结果表明,CYP3A基因编码513个氨基酸,其蛋白质分子量为58.8 ku,理论等电点为7.96。该蛋白是一个稳定蛋白且具有一定的亲水性。二级结构预测可知,CYP3A包含45.2%的α-螺旋、12.3%的延伸链、4.3%的β-折叠和38.2%的无规则卷曲,具有2个显著的跨膜结合区。急性毒性实验结果表明,毒死蜱对白鲢具有很高的毒性,其96h LC50为0.172 mg/L。另外,荧光定量PCR检测发现,毒死蜱对白鲢CYP3A基因表达有明显的抑制作用。
2013&Vol. 37&(5):&892-898
田志环, 康现江, 焦传珍
中华绒螯蟹蜕皮过程中体壁结构和主要成分的变化
采用组织化学和原子吸收分析等方法, 研究了中华绒螯蟹蜕皮过程中体壁结构和主要成分的变化。结果显示: 中华绒螯蟹体壁分为上表皮、外表皮、内表皮和膜层, 糖类物质各层均有分布, 胶原纤维分布在除上表皮外的其他各层。在蜕皮前, 糖类、胶原纤维都被重吸收, 体壁上表皮和外表皮在蜕皮前形成, 内表皮和膜层在蜕皮后形成。体壁粗蛋白含量在蜕皮前期(D1-D3-4期)降低(P&0.05), 蜕皮后A-B期含量极高(P&0.05)。几丁质含量在蜕皮过程中变化不显著(P&0.05), 只是在蜕皮前稍有上升。Ca2+和Mg2+含量在蜕皮前D1期显著低于蜕皮间期和蜕皮前其他时期(P&0.05), 而蜕皮后A-B期降到最低(P&0.05), 蜕下的甲壳中则含有较多的Ca2+和Mg2+ (P&0.05)。Cu2+和Zn2+含量除蜕皮后A-B期升高外(P&0.05), 其余时期变化不明显(P&0.05)。这些研究结果表明, 中华绒螯蟹体壁结构和成分变化与蜕皮周期密切相关。
2013&Vol. 37&(5):&899-904
汪开毓, 牟巧凤, 黄锦炉, 陈德芳, 黄凌远, 王均, 连海
38株维氏气单胞菌分离株的AFLP基因分型研究
试验通过人工设计合成的通用接头以及与接头序列相匹配的专用引物, 对38株维氏气单胞菌分离株和1株维氏气单胞菌标准菌株进行AFLP基因分型研究。结果显示, 采用5对引物使39株维氏气单胞菌扩增出1080条可见条带, 片段长度在50-1000 bp之间, 其中多态性条带727条, 平均每对引物组合产生154条多态性条带, 平均多态性检出率为66.7%。按UPGMA方法对条带进行聚类分析, 建立聚类分支树状图, 将39株维氏气单胞菌分为9个基因型, 其中第四类群基因Ⅳ型包含了14株菌株, 约占总菌数的35.9%, 分布在5个不同的地区, 推测其可能是引起斑点叉尾 发病的主要流行性基因型。不同地区分离的维氏气单胞菌具有地域性差异, 而同一地区分离株既存在相同基因型现象, 也存在基因型多样性现象。
2013&Vol. 37&(5):&905-911
崔素丽, 刘波, 徐跑, 谢骏, 万金娟, 周明
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两种温度下大黄素对团头鲂生长、血液指标及肝脏 HSP70 mRNA表达的影响
实验采用2×2双因子设计, 研究两种温度下在饲料中添加大黄素对团头鲂(Megalobrama amblycephala)生长、血液生理反应及肝脏HSP70 mRNA表达的影响。选取300尾健康的团头鲂[初均重(7.29±0.01) g], 两种温度下(25℃、30℃)分别投喂不添加和添加25 mg/kg的大黄素配合饲料, 养殖时间为77d。结果显示: 在长期30℃高温下, 鱼体增重率(WGR)和特定生长率(SGR)、红细胞积压(HCT)、乳酸脱氢酶(LDH)显著升高, 饵料系数(FCR)和脏体比(VSI)、谷草转氨酶(AST)、总胆汁酸(TBA)显著下降(P&0.05); 添加25 mg/kg大黄素, SGR和肝体比(HSI)、红细胞积压(HCT)、乳酸脱氢酶(LDH)显著升高, 饵料系数(FCR)和摄食率(FR)显著下降(P&0.05)。温度和大黄素对谷丙转氨酶(ALT)和血糖(GLU)无显著影响(P&0.05), 对尿素(UREA)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、补体3 (C3)、补体4 (C4)和肝脏HSP70 mRNA的相对含量存在显著交互作用(P&0.05)。与常温对照组相比, 高温对照组UREA、TG、TC显著下降; 在高温下, 添加大黄素组UREA、TG、TC有升高趋势(P&0.05), C3、C4和肝脏HSP70 mRNA的相对含量显著升高(P&0.05)。以上结果表明, 在饲料中添加25 mg/kg大黄素有助于缓解长期高温对团头鲂血液生理的影响, 提高补体水平和肝脏HSP70 mRNA的相对含量, 促进鱼体的生长。
2013&Vol. 37&(5):&919-928
刘伟, 战培荣, 王继隆, 唐富江
大麻哈鱼胚胎耳石微结构及其群体环境标记
采用人工调控环境方法对黑龙江、绥芬河大麻哈鱼发眼期胚胎群体耳石日轮进行周期性持续标记。实验分４组: 1组为对照组, 2－3组为变温标记组, 4组为“暴气”-变温标记组, 实验用发眼卵1.2万粒。待胚胎发育至耳石日轮结构形成后实施标记。实验胚胎耳石随着标记期间环境周期性变化及其持续的时间, 形成相应变化节律的日轮标记区。获得各实验组设定环境的日轮标记图谱。人工环境标记的耳石日轮图谱, 暗带色度加深, 明带亮度增大, 并可形成生长轮距不同的标记轮, 与对照组耳石微结构有明显区别, 标记率达到100%。初步建立鱼类耳石标记及其识别技术, 适用于大麻哈鱼等鲑鳟鱼类群体标记。作为安全有效、成本低廉的群体标记技术方法, 鱼类耳石日轮标记在鱼类资源评估和增殖放流效果评价中将会得到广泛应用。
2013&Vol. 37&(5):&929-937
海洋无脊椎生物受精动力学模型：研究方法与应用
2013&Vol. 37&(5):&938-944
张东玲, 关瑞章, 黄文树, 熊静
血红蛋白源抗菌片段的研究进展
2013&Vol. 37&(5):&945-956
李扬, 吕颂辉, 齐雨藻
缘辐节藻属硅藻在我国的新记录
2013&Vol. 37&(5):&957-959
[ 11607KB]
徐胜勇, 张辉, 柳本卓, 高天翔
中日褐菖鲉群体形态学比较研究
2013&Vol. 37&(5):&960-966
曾繁振, 俞小牧, 童金苟
三个鲤品种微卫星丰度与遗传多样性分析
2013&Vol. 37&(5):&967-973
林明利, 李钟杰, 夏雨果, 王齐东
蒙古鲌食性驯化及鱼种培育初步研究
2013&Vol. 37&(5):&974-977
罗佳, 石小涛, 刘德富, 陈求稳, 乔晔, 白艳勤, 高柱, 姜伟
两种鲟鱼卵在均匀流场中的漂移特性研究
2013&Vol. 37&(5):&978-981
曾聪, 高泽霞, 罗伟, 刘肖莲, 王卫民
基于454 GS FLX高通量测序的团头鲂ESTs中微卫星特征分析
2013&Vol. 37&(5):&982-988
杨旭瑞, 方仙桃, 徐旭东
一株耐碳酸氢钠产油绿藻的絮凝收集
2013&Vol. 37&(5):&989-992
水生生物学报
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