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竞争抑制ELISA方法的检测建立
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一、 抗体的酶标记及质量鉴定
本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算免疫球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。
二、包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化
1、包被缓冲液的优化
包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mM ph9.6 ）、磷酸盐缓冲液（50mM ph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50 mM ph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：400及1：300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统。同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。
2、最适抗原包被浓度的优化
用优化好的包被缓冲液，将包被抗原（ALB）稀释成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六个浓度，包被微孔板，每孔100ul；竞争抗原浓度为4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶标抗体稀释度为1：300，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析。显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，我们选择临界包被值作为包被抗原量。
三、封闭液、洗涤液及保护液的优化
1、封闭液的优化
采用文献报道的方法进行封闭，其封闭液的组成为：10mM磷酸盐缓冲液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。
2、 洗涤液的配制
采用文献报道的方法配制洗涤液。
3、 酶标板保护液的优化
酶标板经过封闭后在低温下仅能存放2周左右，为了延长固相酶标板上抗原的稳定性，我们增加了一步保护酶标板的程序。在10mM的磷酸盐中加入适量的糖、无关蛋白质、庆大霉素以及二价金属离子，作为酶标板保护剂，在封闭完后加入保护液于4℃冰箱中孵育过夜，同时与未做保护的酶标板进行对照，然后将保护的及未保护的酶标板置于37烘箱中放置15天，考察保护液对酶标板的稳定性的影响。
四、酶标抗体稀释度的优化
抗原包被浓度为4ug/ml,将酶标抗体做系列稀释：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；经孵育、洗涤后、显色终止后，用自动酶标仪分析，选择A值为1.5左右的酶标抗体稀释度为最适工作浓度。
五、酶标抗体保护液的优化
低浓度的酶标抗体极容易受到高温、微生物、以及蛋白酶的影响而失活，严重影响产品的货架期，过去通常将酶标抗体冻干保存，然而这样的保存，不仅由于在冻干的过程中会影响酶标抗体的活性，而且在临床应用中颇为不便。适当的缓冲液以及添加无关蛋白质、糖、防腐剂以及一些含氨基的化合物等都会对对酶标抗体的活性起一定的保护作用，因此我们设计了一组保护剂用于保护酶标抗体，与未添加任何糖蛋白的酶标抗体做对照，将经保护的酶标抗体及未保护的酶标抗体置于37℃烘箱中放置6天，考察保护液对酶标抗体的影响。
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六、底物液的优化
常用的作为酶联免疫吸附试剂有OPD和TMB系统，由于OPD有致癌的危险性以及用前需要溶解等诸多缺点，因此我们选用TMB作为底物系统，采用文献报道的方法：取适量的TMB溶解在DMSO中，然后加入适量的超纯水，配制作为底物B液；溶解适量的过氧化氢尿素于100mM磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制作为底物A液，用前将底物A液及底物B液等体积混合。在文献报道的基础上，我们适当调整了TMB的用量以及过氧化氢尿素的用量，并加入了酶促进剂，与文献报道的底物进行比较。实验方案为：将活化的辣根过氧化物酶分别作1：000；1：：：：800000等系列稀释，比较两种不同配方的底物的灵敏度。
七、标准品及样品稀释液
我们采用10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5%的BSA作为标准品及样品的稀释液。
八、抗原抗体反应时间的优化
抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加，但达到一定的时间后，反应即达到平衡，我们取反应10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min,90min等8个点进行比较，以确定最佳抗原抗体反应时间。
九、底物作用时间的优化
在其它条件相同的情况下，我们取5min,10min,15min,20min,25min,30min,35min,40min,50min,60min,80min等11个时间点进行比较，确定最佳的底物作用时间。
十、剂量反应曲线的建立及曲线拟合方式的确定
在其他参数均已经优化完成的情况下，将抗原标准品用标准品稀释液依次稀释为：160mg/L,80mg/L，40mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L，2.5mg/L，1.25mg/L，0.625mg/L，0.3125 mg/L，0.156 mg/L，0.780 mg/L等12个稀释度，同时设置阴性和空白对照，加入已包被好抗原的酶标板中，同时加入酶标抗体，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析，采用文献报道的4P对数拟合曲线。
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检测牛边缘无浆体抗体的竞争抑制ELISA方法的建立
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抗人VEGF165单链抗体的构建与表达
来源：免疫学杂志 作者：风清扬
摘要: 抗人VEGF165单链抗体的构建与表达
免疫学杂志 2000年第2期第16卷 基础免疫学
作者：赵泽国杨治华冉宇靓刘 军孙立新董志伟
单位：中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤研完所，北京 100021
关键词：人VEGF165。单链抗体。原核表达
摘要：目的 为降低鼠源抗体对人体的免疫原性，构建表达厂VmD11链抗体。方......
专题推荐：
抗人VEGF165单链抗体的构建与表达
免疫学杂志 2000年第2期第16卷 基础免疫学
作者：赵泽国　杨治华　冉宇靓　刘 军　孙立新　董志伟
单位：中国医学科学院，中国协和医科大学研完所，北京 100021
关键词：人VEGF165；单链抗体；原核表达
　　摘　要：目的 为降低鼠源抗体对人体的免疫原性，构建表达厂VmD11链抗体。方法 用overlap PCR构建出单链抗体的基因，克隆入表达载体pKpL―3a，在大肠杆菌pop2136中表达，采用抗原结合ELISA和竞争抑制ELISA测定活性。结果经SDS-PAGE检测，诱导后的细菌表达了26kD的蛋白；Western Blot证实该蛋白为表达的单链抗体。经变性、复性后，该单链抗体可特异结合人VEGF165抗原，并与VmD11具有相同的抗原结合位点。结论成功构建和表达了抗人VEGF165单链抗体，可望进一步应用于肿瘤复发转移的诊治研究。
　　分类号：Q58　文献标识码：A
　　文章编号：(2―04
Construction and expression of anti--human VEGF165 ScFv
zHAO Ze-guo,YANG Zhi-hua,RAN Yu-liang,LIU Jun,SUN Li-xin,DONG Zhi wei(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, Beijing 100021,China)
　　Abstract：Objective In order to reduce the immunogenicity of murine antibody.a ScFv against human VEGF165 was expressed in e-cole. Methods The variable region genes of heavy chain and light chain were amplilied by pCR. The ScFv gene was produced by overlap PCR of VH and VL,then ligated into expression vector pKpL-3a,and expressed in E.coli pop2136.The antigen binding activity of the ScFv was assayed by antigen binding ELISA and competition ELISA with the parent mcAb. Resulls With the metbod of SDS-PAGE, western blot,antigen binding ELISA and competilion ELISA,it confirmed that E coli, expressed the correct 26kD of ScFv,which could specifically bind to the huaman VEGF165 and recognized the same epitope with the parent mcAb. Conclusion An anti-human VEGI165 ScFV was successfully constructed expressed in e-coli.
　　Keywords：human VEGF155;ScYv,procaryotic expression
肿瘤的复发与转移是导致肿瘤病人死亡最主要的原因之一。近年的研究表明，实体瘤的生长、复发、转移及预后部与肿瘤血管形成密切相关。VEGF是目前发现的最重要的血管形成促进剂之一，具有促血管形成[1]和增加血管通透性[2]的双重功能，在肿瘤的发生与转移中起着重要的作用。vmD11是本室制备的抗人VEGF165鼠单抗，具有小和VEGF促血管通透性和促鸡胚绒毛尿囊膜血管形成的活性，在小鼠白发肺转移实验运动模型中，证明可显著地抑制原发瘤的生长和肺转移灶的形成[3]。为降低鼠源单抗对人体的免疫原性，拓宽该单抗在肿瘤诊断治疗中的作用，本研究构建厂VmD11的单链抗体表达载体，在大肠杆菌中表达，并对表达产物进行了抗原特异性分析。
1材料和方法
1．1质粒，宿主菌及酶原核表达载体pKpL―3a[4]及宿主菌pop2136(含有CI857基同，编码温度敏感性γ阻遏蛋白)，由北京医科大学马大龙教授惠赠，含VEGF抗体轻链可变区基因VL的质粒PRGWLC53含重链可变区基因VH的质粒PRUWHC58由本室构建[5]。限制性内切酶及修饰酶购白B．M．公司。TaqplusI购自上海生工公司。Anti―His(c―term)antibody购自Invitrtrogene公司。
1．2PCR引物由上海生工公司合成。
P35’＞GACATCCAGCTGACCCAGTC<3’
P4：5’＞CCACCAGAGCCACCGCCACOGCTIGCCACCGCCACCACGTTTGATCACCACCTTGGTC<3’
P5：5’＞GGCAGCGGTGGCGGrGGCCCTGGTGGAGGTGGCTCTCAGGTCCAAACTGCAGCAGTCTG<3’
P6：5’＞GATGAGATCTAGTGGATGCTGCGGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG<3’
P7：5’＞ACTGACAAGCTTAATGGTGATGATGGTGATGAGATCTAGTGGATGCG<3’
1．3PCR及overlapPCRVEGF单链抗体可变区基因VL的扩增：以P3，P4为引物，PRGWLC53为模板，使用Taqplusl酶，94℃变性10min，60℃退火7min，72℃延伸1．5min，扩增25个循环，补加一轮延伸7min的循环。重链可变区基因VH的扩增：以P5，P6为引物，PRUWHC58为模板，扩增条件与VL相同。OverlapPCR：将VL，VH的产物稀释10倍，各取2μ1混合，加入10×Buffer，Dntp，ddH2O及TaqplusI酶，条件同上进行7个循环后，加入P3，P6,再按上述条件进行25轮扩增。再UoverlapPCR产物为模板，P3，P7为引物，条件同VL扩增25个循环。
1．4VEGFScFv表达载体的构建原核表达载体pKpL―3a经StyI酶切后，Klenow补平，再用HindⅢ酶切，PCR产物经Klenow补平，用HindⅢ部分酶切，与经酶切的表达载体pKpL―3a连接，构建出表达载体，如图1。
图1VEGFScFv表达载体的构建
Fig1constructlonofVEGFscFvexpresstionvector
1．5VEGFScPv的表达及变性复性接种含有重组质粒的单个菌落至50mlLB中,30℃培养至OD600为1.0时，加入50ml50℃预热的LB，42℃诱导6h。收集细菌，超声破碎后离心获得包涵体，用SDS-PAGE分析及WesternBlot检测。包涵体用洗涤液(2mmol／LEDTA，10mmol／LTrisCl，1％Triton―x―100，Ph8.0)洗涤3次后，加入变性液(6mol／L盐酸胍，100mmol／LThisCl，2mmol／LEDTA，Ph8．0)室温变性4h以上，离心留上清，用TEAbuffer[6]稀释，4℃放置16h复性，再用TEAbuffer透析去除盐酸胍。
1．6抗原结合ELISA及竞争抑制EUSA用10μg/mlVEGF165抗原包被酶标板，加入重组克隆诱导表达产物，以空载诱导表达产物为阴性对照，37℃孵育1h后加入抗His6的鼠单抗，反应后再加入羊抗鼠IgG酶标抗体，OPD显色，测OD490用2．5μg/mlVEGF165抗原包被酶标板，加入HRP标记的原亲本鼠单抗VmD11或VmD11酶标抗体与不同浓度的单链抗体，37℃孵育1h，OPD显色，测OD490。竞争抑制率按如下公式计算：
竞争抑制率＝VmD11-HRPOD490-混合抗体OD490/VmD11-HRPOD490×100％
2．1VEGFScFv表达载体的构建用P3、P4从PRGWLC53中扩出320bp的VL基因，用P5、P6从PRUWHC58中扩出354bp的VH基因，用P3、P6进行OverlaPPCR，扩增出717bp的单链抗体基因片段，再以此产物为模板,用P3、P7扩增，获得在OverlapPCR产物下游加上His6基因和HindⅡ酶切位点的单链抗体基因，1．2%的琼脂糖电泳分析结果如图2。744bp的单链抗体基因与经酶切的原核表达载体pKpL―3a连接后，转化宿主菌pop2136，提取质粒，经HindⅢ，StyⅠ，PvuⅡ+SalⅠ及SalⅠ+HindⅢ酶切鉴定，共获得4个含单链抗体基因的重组克隆。
图2PCR扩增结果
Fig2?ResultofPCRamplification
Lane1:DNA/Hindmarker
Lane2:PCRproductofVLgene
Lane3:PCRproductofVHgene
Lane4:overlapPCRproductelVLandVHgene
Lane5:PCRproductcotainingHis6gene
2．2VEGFScFV表达及鉴定重组克隆诱导表达产物在SDS―PAGE电泳分析中，可见重组克隆表达了一条约26kD的蛋白带，空菌诱导和重组克隆未诱导无该蛋白的表达，如图3(a)。以anti―His(C―term)antibody为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western―Blot,结果显示，重组克隆仅在26kD处着棕色，而空载和重组克隆未诱导没有着色带，这表明重组克隆确实表达了含有His6基因的VEGF单链抗体，如图3(b)。
图3(a)SDS-PAGE结果
Fig3(a)ResultofSDSpolyacrylamidegeleIectrophoresis
Lane1:centrifugedpelletselinducedpop2136coltainingrecombinantplasmidaltersonicalion
Lane2:centrifugedpelletsofutdnducedpop2136cotainingrecombinantplasmidaftersonication
Lane3:centrifugedpelletsofinduceduntransfomuatedpop2136aftersonication
Lane4:middlerangemolecularweightproteinmarker
图3(b)Western-Blot结果.
Fig3(b)ResultofWesternBlot
Lane1:middlerangemolecularweightproteinmarker
Lane2:centrifugedpelletsofinduceduntransformatedpop2136aftersonication
Lane3:centrifugedpelletsofuninducedpop2136cotainingrecombinantplasmidaftersonication
Lane4:rertrifugedpelletsofinducedpop2136cotainingrecombinantplasmidaftersonication
2．3VEGF单链抗体与VEGF抗原特异性结合分析ELISA结果显示(见表1)，空载体对照OD490分别为O，05±0.02至O．02±O．01，重组表达的单链抗体在1:1稀释时OD490为1.73±0．02；在1：32稀释时为0．29±0．02，而且随着抗体浓度的下降，OD490值逐渐降低，这表明VEGF单链抗体能与VEGF抗原特异性结合。　表1抗原结合ELISA结果
TablResultofantigenbindingELISA
ND：notdone
2．4竞争抑制ELISA分析VEGF单链抗体的抗原结合特异性的结果见表2。鼠单抗VmD11与单链抗体混合反应的OD490值随着单链抗体浓度的增加而逐步降低。当单链抗体为0．84，1．68，3．36，6．68和13．45μg时其竞争抑制率分别为13．9％，27．9％，34.5%，51．5％和77．8%。这表明VEGF单链抗体与亲本鼠单抗VmD11结合同一抗原表位，证明其与原亲本鼠单抗有相同的抗原结合特异性，同时表明该单链抗体有较好的亲和力。
表2竞争抑制ELISA结果
Tab2ResultofcompetitionELISA
单链抗体是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。大小为完整抗体的1／6，分子量为25kD。这种小分子的抗体在肿瘤和心血管疾病的体内诊断和治疗、体外疾病诊断、生物传感器、生物分离作用以及抗体的结构功能研究等方面有潜在的应用前景。VEGF单链抗体在国内外目前尚未见报道。本研究成功构建了VEGF单链抗体表达载体；表达产物变性、复性后测产量为269μg／ml，具有与人VEGF165抗原的特异结合活性，并证明有较好的亲和力。VEGF单链抗体的研制成功，可大大降低鼠单抗的免疫原性，且分子量小，为肿瘤的诊断和导向治疗提供了一种新的途径。在大肠杆菌中以包涵体的形式表达单链抗体具有产量高，速度快，成本低的优点，同时包涵体有助于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，易于分离表达产物。但包涵体蛋白必须在变性剂，例如尿素或盐酸胍中解聚溶解后，通过柱层析、透析除去变性剂或将其稀释进行重折叠，得到有活性的单链抗体。在本单链抗体的复性研究中，作者发现该单链抗体的复性以及活性的长期维持仍然是一个非常复杂的问题。作者曾先后运用柱层析复性，尿素梯度透析，TrisCl缓冲液稀释等方法复性，均告失败；当采用TEA缓冲液透析或稀释复性，获得的单链抗体有较好的活性，并能在其中较长时间地保持良好的活性，当将其再用PBS透析，抗体活性将在24h内完全丧失，可见TEA缓冲液对该单链抗体活性的维持有重要的作用,尤其是其中的L―Arg可以促进VEGF单链抗体的稳定性,防止分子聚集产生沉淀，具有最重要的作用。
　　基金项目：国家863计划资助项目(863-102-09-02-03)
　　作者简介：赵泽国(1975-)，男，河南洛阳市人，博士研究生，主要从事肿瘤免疫及基因工程抗体的研究。
　　参考文献：
　　［1］PLOUET J，SCHILLING J，GOSPODAROWICZD,et al，Isolation and characterization of a newly identifledendothelial cell mitogen produced by atT―20 cells[J].EMBO J，01～3806．
　　［2］KECK PJ，HAUSER SD．KRIVLG，et al．Vascular permeability factor，an endothelial cell mitogen related to pIXSF[J].Science．：.
　　［3］杨治华，王贵齐，杨房生，等．抗人VEGF单克隆抗体抑瘤抗转移的实验研究[J］．中国肿瘤生物治疗杂志，0～213．
　　［4］周宝宏，马大龙，狄春辉，等．人单核细胞衍生的体外扩增及其在大肠杆菌中的高效表达[J]．中华和免疫学杂志，4～177．
　　［5］冉宇靓，杨治华，王贵齐，等．抗血管内皮细胞生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与序列分析[J].中国医学科学院学报，3～427．
　　［6］GRUBER M，SCHODIN BA，WILSON ER，et al．Efficient tumor cell lysis mediated by a bispeeific single chainantibody expressed in Escherichia coli[J]．J Immunology，：．
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标题: 竞争抑制ELISA方法的建立(包被,酶标抗体,抗原,底物,缓冲液)
摘要: [竞争抑制ELISA方法的建立(包被,酶标抗体,抗原,底物,缓冲液)] 一、?抗体的酶标记及质量鉴定本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex?G200?凝胶层析进行纯化，洗脱液为0 2mol L?pH7 4的PBS，流速为15ml h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标， [关键词:酶标抗体 包被 抗原 底物 缓冲液 显色 标准品 酶标仪]……
一、 抗体的酶标记及质量鉴定本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算免疫球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。
二、包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化1、包被缓冲液的优化包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mM ph9.6 ）、磷酸盐缓冲液（50mM ph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50 mM ph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：400及1：300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统（表5）。同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。2、 最适抗原包被浓度的优化用优化好的包被缓冲液，将包被抗原（ALB）稀释成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六个浓度，包被微孔板，每孔100ul；竞争抗原浓度为4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶标抗体稀释度为1：300，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析（表6）。显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，我们选择临界包被值作为包被抗原量。
三、封闭液、洗涤液及保护液的优化1、封闭液的优化采用文献报道的方法进行封闭，其封闭液的组成为：10mM磷酸盐缓冲液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。2、 洗涤液的配制采用文献报道的方法配制洗涤液。3、酶标板保护液的优化酶标板经过封闭后在低温下仅能存放2周左右，为了延长固相酶标板上抗原的稳定性，我们增加了一步保护酶标板的程序。在10mM的磷酸盐中加入适量的糖、无关蛋白质、庆大霉素以及二价金属离子，作为酶标板保护剂，在封闭完后加入保护液于4℃冰箱中孵育过夜，同时与未做保护的酶标板进行对照，然后将保护的及未保护的酶标板置于37烘箱中放置15天，考察保护液对酶标板的稳定性的影响。
四、酶标抗体稀释度的优化抗原包被浓度为4ug/ml,将酶标抗体做系列稀释：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；经孵育、洗涤后、显色终止后，用自动酶标仪分析（表7），选择A值为1.5左右的酶标抗体稀释度为最适工作浓度。
五、酶标抗体保护液的优化低浓度的酶标抗体极容易受到高温、微生物、以及蛋白酶的影响而失活，严重影响产品的货架期，过去通常将酶标抗体冻干保存，然而这样的保存，不仅由于在冻干的过程中会影响酶标抗体的活性，而且在临床应用中颇为不便。适当的缓冲液以及添加无关蛋白质、糖、防腐剂以及一些含氨基的化合物等都会对对酶标抗体的活性起一定的保护作用，因此我们设计了一组保护剂用于保护酶标抗体，与未添加任何糖蛋白的酶标抗体做对照，将经保护的酶标抗体及未保护的酶标抗体置于37℃烘箱中放置6天，考察保护液对酶标抗体的影响。
六、底物液的优化常用的作为酶联免疫吸附有OPD和TMB系统，由于OPD有致癌的危险性以及用前需要溶解等诸多缺点，因此我们选用TMB作为底物系统，采用文献报道的方法：取适量的TMB溶解在DMSO中，然后加入适量的超纯水，配制作为底物B液；溶解适量的过氧化氢尿素于100mM磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制作为底物A液，用前将底物A液及底物B液等体积混合。在文献报道的基础上，我们适当调整了TMB的用量以及过氧化氢尿素的用量，并加入了酶促进剂，与文献报道的底物进行比较。实验方案为：将活化的辣根过氧化物酶分别作1：000；1：：：：800000等系列稀释，比较两种不同配方的底物的灵敏度（表10）。
七、标准品及样品稀释液我们采用10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5%的BSA作为标准品及样品的稀释液。
八、抗原抗体反应时间的优化抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加，但达到一定的时间后，反应即达到平衡，我们取反应10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min,90min等8个点进行比较（表11），以确定最佳抗原抗体反应时间。
九、底物作用时间的优化在其它条件相同的情况下，我们取5min,10min,15min,20min,25min,30min,35min40min,50min,60min,80min等11个时间点进行比较（表12），确定最佳的底物作用时间。
十、剂量反应曲线的建立及曲线拟合方式的确定在其他参数均已经优化完成的情况下，将抗原标准品用标准品稀释液依次稀释为：160mg/L,80mg/L，40mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L，2.5mg/L，1.25mg/L，0.625mg/L，0.3125 mg/L，0.156 mg/L，0.780 mg/L等12个稀释度，同时设置阴性和空白对照，加入已包被好抗原的酶标板中，同时加入酶标抗体，经孵育、显色、终止后用自动分析（表12），采用文献报道的4P对数拟合曲线
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