Basel大学揭示重要的发育机制 - 今日头条()
Basel大学的研究人员在纳米抗体（nanobodies）的基础上开发了一种新技术，并将其命名为“Morphotrap”。他们通过这一技术首次在果蝇中选择性操纵和分析了Dpp的分布，Dpp是影响果蝇翅膀发育的重要成形素之一。这项研究最近发表在Nature杂志上，为器官生长研究提供了新的实用工具。器官生长和空间模式的调控是器官发育的两大基础。Markus Affolter教授领导研究团队用Morphotrap研究了果蝇翅膀的发育过程。他们发现Dpp只影响器官芽中间区域的生长，对周围没什么作用。据介绍，这是GFP纳米抗体首次成功用于这类研究。纳米抗体是来自骆驼的小抗体片段，是人们用基因工程方法克隆骆驼重链抗体可变区得到的单域抗体。与传统IgG抗体相比，纳米抗体具有分子质量小、容易生产、稳定性好、抗原结合力高等特点。Affolter及其同事尝试通过这种抗体成功操纵了活体内的分子。研究显示，使用GFP纳米抗体的Morphotrap技术，可以更快更有效地在活体内研究GFP标记蛋白的功能。
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(C) 2016 今日头条 违法和不良信息举报电话：010-公司名称：北京字节跳动科技有限公司1、什么是单克隆抗体?有哪些优点和缺点?2、简述单克隆抗体的基本过程?3、如何制备杂交瘤细胞?
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单克隆抗体是利用体外培养技术生产的抗体,它由于是由一个细胞分裂而来的,所有只含有一种抗体.单克隆抗体的优点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制,并且来源容易.这些优点使其广泛应用于抗肿瘤等领域 缺点就是生成的抗体只针对1种抗原决定簇,比较单一.基本过程：1.抗原的处理2.在小鼠体内植入抗原（免疫）3.取免疫鼠的B淋巴细胞4.与鼠的骨髓瘤细胞用PEG细胞融合5.在多孔板上筛选.杂交瘤细胞就是上面的34两步
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扫描下载二维码纳米抗体三种原核表达系统的比较及耐热性研究--《西北农林科技大学》2014年硕士论文
纳米抗体三种原核表达系统的比较及耐热性研究
【摘要】：纳米抗体（nanobody，Nb）是一类只含重链可变区的单域抗体，存在于骆驼及一些软骨鱼类体内。目前，利用基因工程技术可实现纳米抗体真核和原核表达。尽管纳米抗体相比传统抗体而言具有良好的可溶性，但由于不同纳米抗体空间结构存在较大差异，因此，使用原核表达系统进行纳米抗体表达时，仍会存在表达量、可溶性以及活性较低等问题。为解决这类问题，一般使用融合标签技术，即在目的蛋白的N端或C端融合可溶性的某种或多种标签。本研究为了获得猪圆环病毒II型（PCV2）Cap蛋白纳米抗体的最佳原核表达系统，我们选取两种空间结构完全不同的PCV2Cap蛋白的纳米抗体为模型，选用三种分别带有MBP、SUMO、His融合标签的原核表达载体pMAL-c2x、pE-SUMO、p-COLD DNA I。然后从表达量、可溶性以及抗原结合活性三方面对两种纳米抗体进行比较，结果发现pE-SUMO表达载体更有利于纳米抗体的原核表达，SUMO标签较MBP和His标签更适用于纳米抗体的原核表达，且当SUMO标签去除后，并不影响处于天然状态下的纳米抗体的抗原结合活性。以上结果可为其他纳米抗体的原核表达提供参考。
目前，检测PCV2主要采用间接ELISA方法。此法是通过检测血清中特异性抗体来判断PCV2的感染情况，但此法却无法准确检测出已感染但尚未产生特异性抗体的动物。因此，建立一种以检测PCV2抗原为目的的双抗体夹心ELISA会比传统的间接ELISA更有效。找到一种特异性结合活性好、稳定性高的抗体作为包被抗体是建立双抗体夹心ELISA方法的关键。基于此，本研究利用pE-SUMO表达载体对实验室前期筛选获得的6种不同序列的PCV2Cap蛋白纳米抗体进行表达，不同温度处理6种纳米抗体，结果发现6种纳米抗体的耐热性均较高。通过耐热性研究找出结合活性较好且稳定性较高的抗PCV2Cap蛋白纳米抗体，为后续建立PCV2双抗体夹心ELISA检测方法提供关键的抗体工具。
本研究的主要内容和结果如下：
1.三种纳米抗体表达载体的构建
通过引入限制性酶切位点BamH I和Sal I，将抗猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体（Nbs）连入经相同酶酶切处理后的pCold、pMAL-c2x表达载体，构建重组纳米抗体表达载体pCold-Nbs、pMAL-c2x-Nbs；通过引入限制性酶切位点Bsa I和BamH I，将Nbs连接入经过相同酶酶切处理后的pE-SUMO表达载体，构建重组表达载体pE-SUMO-Nbs。
2.融合纳米抗体的诱导表达及比较
重组质粒pMAL-c2x-Nbs、pE-SUMO-Nbs、pCOLD-Nbs分别转化感受态细胞TB1、Rosetta、BL21（DE3），分别在0.3mmol/L IPTG37℃3h、0.4mmol/L IPTG25℃4h、0.4mmol/L IPTG15℃6h条件下进行诱导表达。12%SDS-PAGE电泳分析可溶性表达情况，结果MBP标签促溶性效果最明显；BCA试剂盒测定融合纳米抗体产量，大小为His-SUMO-NbsMBP-NbsHis-Nbs；间接ELISA检测融合纳米抗体的抗原结合活性，MBP-Nbs、His-SUMO-Nbs、His-Nbs均能识别特异性抗原（猪圆环病毒II型Cap蛋白），但却存在显著差异（P〈0.05），活性最大的为His-SUMO-Nbs，而MBP-Nbs活性最低。综合分析后得出SUMO标签较MBP、His标签更适合用于纳米抗体的原核表达，融合SUMO标签的pE-SUMO表达载体较其余两种载体表达纳米抗体更具优势。
3.SUMO标签的切除及天然纳米抗体活性检测
使用SUMO蛋白酶1（Ulp1）酶切His-SUMO-Nb2以移除SUMO标签，通过TALONMetal Affinity Resin纯化获得天然的Nb2。双抗体夹心ELISA检测Nb2活性，并与His-SUMO-Nbs活性进行比较，结果与阴性对照相比纳米抗体反应值均为阳性（S/N〉2.1），天然单体Nb2与His-SUMO-Nb2两者的抗原结合活性反应值较为接近，差异不显著（P〉0.05），表明SUMO标签的存在对纳米抗体的抗原结合活性不会有影响，进一步说明SUMO标签为纳米抗体原核表达的最佳标签。
4.猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体耐热性研究
采用pE-SUMO原核表达载体将筛选得到的6种抗猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体进行表达。温度处理后，间接ELISA检测6种纳米抗体的抗原结合活性。结果显示虽然6种纳米抗体活性都有所减少，但相对血清抗体而言，抗猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体在高温条件下仍表现出结合抗原的能力，表明其具有良好的耐热性。比较ELISA结果发现猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体Nb2的稳定性较其余纳米抗体更好，并且Nb2原始的抗原结合活性也较好，因此，可将其作为包被抗体用于建立检测PCV2双抗体夹心ELISA的研究中。
【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：S852.43【目录】：
摘要5-7ABSTRACT7-11第一章 纳米抗体简介及大肠杆菌中外源蛋白可溶性表达的研究11-21 1.1 纳米抗体简介11-15
1.1.1 纳米抗体结构特点11-13
1.1.2 纳米抗体的功能特性13
1.1.3 纳米抗体的应用13-15 1.2 大肠杆菌原核表达系统的研究概况15-17
1.2.1 大肠杆菌表达系统表达外源基因的优缺点15-16
1.2.2 提高大肠杆菌表达系统表达外源蛋白可溶性的方法16-17 1.3 融合标签技术17-21
1.3.1 融合标签的种类17-20
1.3.2 融合标签的作用20-21第二章 三种重组抗猪圆环病毒 II 型（PCV2）Cap 蛋白纳米抗体表达载体的构建及融合纳米抗体诱导表达的比较21-36 2.1 材料21-23
2.1.1 PCV2 Cap 蛋白、纳米抗体、菌株、载体21-22
2.1.2 酶、纯化树脂、抗体22
2.1.3 主要药品及试剂22
2.1.4 溶液配制22-23
2.1.5 主要仪器23 2.2 方法23-29
2.2.1 三种纳米抗体表达载体的构建23-24
2.2.2 重组纳米抗体的诱导表达24-25
2.2.3 重组纳米抗体的大量诱导表达25-26
2.2.4 三种融合标签纳米抗体的纯化26-27
2.2.5 三种融合标签纳米抗体蛋白量的测定27-28
2.2.6 间接 ELISA 检测三种融合标签纳米抗体抗原结合活性28-29 2.3 结果29-34
2.3.1 三种重组纳米抗体表达载体诱导表达分析29-30
2.3.2 三种表达载体表达的融合标签纳米抗体的蛋白表达量30-32
2.3.3 间接 ELISA 检测融合纳米抗体抗原结合活性32-34 2.4 讨论34-35 2.5 小结35-36第三章 SUMO 标签的移除对纳米抗体的影响36-43 3.1 材料36-37
3.1.1 Cap 蛋白、纳米抗体、SUMO 蛋白酶 136
3.1.2 血清及抗体36
3.1.3 主要试剂36
3.1.4 溶液配制36-37
3.1.5 主要仪器37 3.2 方法37-39
3.2.1 天然纳米抗体的酶切获得37-38
3.2.2 双抗体夹心 ELISA 进行活性检测38-39 3.3 结果39-40
3.3.1 天然纳米抗体的获得39
3.3.2 双抗体夹心 ELISA 检测抗体活性39-40 3.4 讨论40-41 3.5 小结41-43第四章 抗猪圆环病毒 II 型 Cap 蛋白纳米抗体耐热性的研究43-50 4.1 材料43-44
4.1.1 纳米抗体、血清抗体、抗原43
4.1.2 主要试剂43
4.1.3 溶液配制43-44
4.1.4 主要仪器44 4.2 方法44-45
4.2.1 pE-SUMO 表达载体表达筛选获得的全部纳米抗体44
4.2.2 纳米抗体室温放置44-45
4.2.3 不同温度孵育处理45 4.3 结果45-48
4.3.1 抗猪圆环病毒 II 型 Cap 蛋白纳米抗体耐热性45-48 4.4 讨论48-49 4.5 小结49-50结论50-51参考文献51-60致谢60-61作者简介61
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与单克隆抗体相比，基因工程抗体具有的四个优点
1．通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应； 　　2．基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位； 3．根据治疗的需要，制备新型抗体； 　　4．可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。
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