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PCR扩增产物的克隆实验方法的比较
本帖最后由 寒枫 于
13:18 编辑
PCR扩增产物的克隆可以：（1）获得目的DNA片段；（2）用于原核表达的研究；（3）广泛应用于分子生物学相关研究。
平端连接法
实验方法原理：
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。
这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
实验步骤：
一、PCR反应
1.&&依次混匀下列试剂
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反应缓冲液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4种dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（约1 ng）：0.5 μl
（8）混匀后离心5秒。
2.&&将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl约2.5 U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3.&&用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
取10 μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
1.&&酚/氯仿法
（1）取反应产物加100 μl TE。
（2）加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
（3）再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小离心机上10000 rpm离心10 min，吸净上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2.&&Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
（3）加1 ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
（5）将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2 ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50 μl TE或水，静止1分钟后，12 000 g离心20秒。
（8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、载体加dT尾
1.&&将1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2.&&在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4 μl 4种dNTP改为4 μl 25 mM dTTP。
3.&&加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
4.&&按前面三中所述，用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
5.&&加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1.&&在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。
2.&&加1 ml T4DNA连接酶，1 ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
3.&&取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1.&&在50 ml的PCR产物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
2.&&37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3.&&用酚:氯仿抽提2次。
4.&&乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH2O中。
5.&&质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1 ml （约0.1 mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ，连接缓冲液1 ml 。
6.&&取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
注意事项：
1.&&PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。
2.&&PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3.&&吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
4.&&加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
5.&&应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
6.&&纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7.&&PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。
一、 PCR反应中的主要成份
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
（1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。
（2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。
（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
（5）在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。
（6）两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
（7）引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。
（9）简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
（10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
2.&&4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)
（1）dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。
（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200 μmol/L。
（3）理论上4 种 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反应中合成2.6 μg的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
（1）Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
（2）通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5 mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
（3）在PCR反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。
（1）PCR反应必须以DNA为模板进行扩增， 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
（2）就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。
（3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。
（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5.&&Taq DNA聚合酶
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。
Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。
所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶， 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：
（1）PCR产物经酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
6.&&反应缓冲液
（1）反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg 2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
（2）反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。
（3）各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
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实验方法原理：
TA克隆 系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点（MCS）中。
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。
实验步骤：
一、大肠杆菌感受态细胞的制备
1.&&取大肠杆菌JM109保存液50 μl，接种于4 ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300 rpm振荡培养过夜，第二天取50 μl 转接到新的4 ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3 h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1 ml菌液于1.5 ml离心管中，冰浴10 min。
2.& &4℃，5 000 rpm离心2 min，去上清液。
3.&&加入750 μl预冷的0.1 M CaCl2重悬菌体，冰浴30 min。
4.& &4℃，5 000 rpm离心2 min，弃上清液。
5.&&加入100 μl 冰冷的0.1 M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2 h后，4℃保存备用。
二、重组DNA的转化
1.&&将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。
2.& &于100 μl感受态细胞中加入10 μl连接产物，冰浴30 min。
3.&&将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2 min。
4.&&在离心管中加入SOC培养基300 μl，枪头混匀，37℃、150 rpm温和摇振60 min。
5.&&将200 μl 转化菌液均匀地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。
三、重组质粒的鉴定
方案一： 菌落PCR
（1） 制备PCR混合液。
（2） 用经灭菌的10 μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
（3） 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。
（4） 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。
（5） 按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3 min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。
（6） 取5 μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
方案二： 质粒PCR
1.&&碱裂解法少量制备质粒DNA
（1）用离心管收集4 ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14 000 rpm离心30秒，弃尽上清。
（2）用250 μl已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。
（3）加入250 μl Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5 min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。
（4）加入400 μl Buffer S3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2 min，14 000 rpm离心10 min。
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。
（5）将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5 500 rpm离心1 min。
（6） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入500 μl Buffer W1，5500 rpm离心1 min。
（7）弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入700μl已加无水乙醇的Buffer W2，5 500 rpm离心1 min，以同样的方法再用700 μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。
（8） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，14 000 rpm离心1 min。
（9）连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30 μl Eluent或去离子水。
（10）室温静置2 min，14 000 rpm离心1 min洗脱DNA。
（11） 取5 μL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。
2.&&抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。
（1） 加TE稀释质粒DNA溶液至300 μL。
（2）加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3 min。
（3）14 000 rpm 离心5 min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3 min。
（4） 14 000 rpm离心5 min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3 min。
（5） 14 000rpm离心5 min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15 min，沉淀质粒DNA。
（6） 14 000rpm离心13 min，弃上清液，沉淀加入200 μL 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20μL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。
（7） 取5 μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
3.&&质粒PCR
（1） PCR反应体系如下：
（2）PCR 扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：
94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。
（3） 取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。
注意事项：
1.&&要获得目的基因的TA克隆 ，PCR 产物的特异性要好。
2.&&PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。
3.&&在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。
4.& &制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。
5.&&42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。
6.& &菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
8.&&Ligation Solution I 请于冰中融解。
9.&&在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。
10.&&克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。
11.&&按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。
12.& &连接反应请在16℃下进行，温度升高 (&26℃) 较难形成环状DNA。
13.& &连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。
14.& &感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：JM109，DH5a等。
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（T-Vector）是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
大部分耐热性进行PCR反应时都具有在PCR产 物的3’末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。
相对于另一种非定向克隆——平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、高效、一步到位的非定向克隆法。有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高。
商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。自制T载体：一种常见的自制方法是利用制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下：
其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3’ T末端。相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。最常见的T-Vector要属Takara公司的pMD系列（pMD18-T、pMD19-T、pMD20-T以及对应的去除多克隆酶切位点的Simple载体，如pMD19-T-Simple）和Promega公司的pGEM系列（pGEM-T和pGEM-T Easy）。以下分别是两种T载体的序列：（序列已经经过调整，直接将需要插入的片段粘贴到序列的头端或者尾端即可得到最终的质粒序列）Takara公司pMD19-T载体序列
此处为省略显示，如需查看请Promega公司pGEM-T载体序列
此处为省略显示，如需查看请（ ）
参考资料：1. ;2. ;3. ;4. ;5. ;
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现在编辑器加了引用功能还挺好用的，比较方便引用参考资料了
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总结的很好，虽然平时都在用T载体，但还真没总结过这些
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还能自制T载体，以前还真没留意过，都是没钱给逼的
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这个好，支持一下
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看看序列，刚好用到！
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虚心向楼主学习
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向楼主的分享精神致敬
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很好，楼主说的非常对
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向楼主的分享精神致敬
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CRISPR，被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统
据世界卫生组织统计，2008年全世界新增肿瘤人数约为1270万，同年死于肿瘤的患者约为760万人。
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