求助Gateway 方法构建载体构建的经验

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-02-14 05:58 标签： 腺病毒载体构建
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载体构建 求助
我现在做的是将1400bp的目的片段连接到1301载体上，具体方法是，先将添加了Xbal和BamH1酶切位点的pcr产物与pmd18-T连接后转化到感受态细胞中，提取质粒。用Xbal和BamH1分别双酶切含有目的片段的质粒和1301质粒。酶切产物胶回收后用solution1 4度连接过夜，之后将连接产物转化到感受态上，可是每次培养基上都不长菌，不知道是不是连接体系有问题，（1：1,1:2，1：1：3,1:4，1:5的体系我都试过，就是不长菌），这个实验我做了好长时间了，就是不成功，还望哪位仁兄给指点一下。不胜感激！
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Gateway_载体构建
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菌液PCR的经验【转载】
此方法可能很多师兄师姐们都在用，只是当时的确没有找到相关的详细说明，学弟再次把自己摸索出来的一点心得写出来，高手就多多指正，没做过的就相互学习下，见笑）
由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体
起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了
他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性
我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体
挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个
按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定
结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）
也难怪老板一口回绝
只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命
后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）
.0的MCS两端有T7和SP6
如果我用T7和SP6作为引物，则
1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段
2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp
如下图所示：
后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6
因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段
这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题
总结如下：
1.PCR引物的选择（ 此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）
& &选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物
如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R
& && && && && && && && && && && & 或SP6+目的基因-F
& && & pCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-R
& && & pEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）
仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合
2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）
挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中
37°C 200rpm摇床&&摇2-4小时以上
（通常赶时间的 话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）
3.菌液的处理
无需特殊处理菌液& &或& &取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins& & 甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）
提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉
我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸
4.pcr体系：无特殊要求
同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度
5.模板的量：1-2ul
未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）
6.退火温度：55-58°C
此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成
T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°
我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带
7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来
8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错 ，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步
以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！
再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！
P.S.&&通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于&&小鸟级别的分生试验者，老鸟。。。嘿嘿，那就不用了，给大家看一张后来我做的菌液PCR的图：
这张图上共有4个基因的重组子
除了第二个基因的第二个泳道有非特异性的产物，其他均为目的条带
补充说明如下：
鉴于很多同仁提到的假阳性的问题
我补充说明一下
1.我需要做菌液PCR的目的是为了选取基因重组中的阳性克隆
如果只是鉴定已获取的阳性质粒或是扩增
则不存在假阳性一说
2.我后面也补充说明了
通过调整合适的插入片段和载体的比例，基本上可以使得每个长出的菌落均为阳性菌落
贴一张比例很合适连接之后的图
图片上全部为大菌落，这些菌落我全做了PCR和酶切鉴定，全部含有目的片段
后一组我后来通过浓度梯度做出来的图片
插入片段和载体的mol比分别为4:1，7:1，10:1
3种比率中7：1的是阳性连接比率最高的
4：1的空载体最多
所以，我想强调的是：
通过调整合适的插入片段和载体的mol比例
是可以完全做到长出的菌落全部为阳性菌落的
另外，在挑取菌落的时候也是有讲究的
对于阳性菌落和无插入片段的载体菌落大小上是有一定区别的
我在文章后来提到的通过选择具有一定特征的菌落以达到很高的阳性率也是可以做到的就是这个意思
我想通过这些手段也完全可以使菌液PCR显得多余
所以我在文章的开头也说了
这篇文章应该是适合各位新手开始做重组时候的方法
最后还有一个因素就是大家做重组的步骤上或许也有一些原因
我用的是Invitrogen的T4 DNA ligase
条件：26°C&&2-4h& &（我知道最好是16度过夜，只是苦于我们这里的实验室老师不让我们用PCR仪过夜，其他的设备又不能维持稳定的温度，且还和室温有关）
转化：取1-2ul转化20ulTop10感受态细胞
& && && & 最后取150ul涂板，37°C过夜
中间我也冥思苦想，考虑假阳性的源头
最后考虑到的唯一的可能就是来自于未能和载体连接上的插入片段
我是直接取的连接产物去做转化
（Invitrogen推荐的是将连接产物稀释至少10倍以上之后取2ul转化）
自然这部分未能连接上的片段也被带入到扩增体系中
最后这部分微量的插入片段被PCR仪扩增出来
不知各位前辈是否有更好的建议
我的这篇文章全当是抛砖引玉
各位对菌液PCR有什么更好的提议的多多提出来
p.s.&&一直在螺旋网当看客，学习技术
& && & 自己构建载体也有6个月了
& && & 总共构建了54个阳性载体用于后续的研究
& && & 中间许多心酸自不必说
& && &最近处于收尾和交接后续工作的时刻
& && &昨晚兴起才想起该为大家留点东西
今天看到自己的帖子上了螺旋网首页
哈哈 ，心里还是很比较感激这长时间老板的压迫的哈
谢谢大家的关注
后面补上来的菌落的图是我今天临时照的
由于板子放在4°C冰箱有一段时间了
所以周围长了一些卫星灶
还请见谅哦
提议：大家可以对于载体构建也提一些自己的体会
& && && & 虽然网上也不少，但是我在自己构建过程中也碰到了一些问题， 倒是满希望和大家一起来分享的
这个帖子都说了 是针对新手 您的高手 不需要看啊
你仔细看看 就明白了 不仅仅是大肠杆菌 关键是引物的设计
高手啊 牛逼人物啊 小弟是新手
没有长菌落是比较正常的事情啊 做多了 就好了啊
前面都是一做就长的，不过测序??质粒，哈哈。这次居然啥都没长
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